蛋白质组学研究及其进展.ppt

生物技术专题蛋白质组学的研究方法和进展，从基因组到蛋白质组，对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究，已经成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。第一节蛋白质组学的概念和发展历史第二节蛋白质组学研究方法概述第三节蛋白质组学在疾病研究中的应用第一节蛋白质组学的概念和发展历史。蛋白质组学最早是由澳大利亚学者威廉姆斯和威尔金斯在1994年提出的，它起源于蛋白质和基因组这两个词的杂合性，意指由细胞或组织基因组表达的蛋白质。蛋白质组学的概念对应于基因组中所有蛋白质的整体，并不限于一种或几种蛋白质。同一基因组在不同细胞和组织中的表达是不同的。在空间和时间上动态变化的整体。蛋白质组学是一门利用各种技术手段研究蛋白质组的新科学。其目的是从整体角度分析细胞内蛋白质组成、表达水平和修饰状态的动态变化，了解蛋白质之间的相互作用和联系，揭示蛋白质功能和细胞生命活动的规律。主要研究内容，了解特定细胞、组织或器官的蛋白质类型；阐明各种蛋白质分子如何形成类似电路的网络。描述蛋白质的精确三维结构并揭示其结构的关键部分，如与药物结合并决定其活性的部分。研究对象基础技术研究水平，功能蛋白质组学(functional protocol，functional protocol)，功能蛋白质组：细胞在某一阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。它介于对单个蛋白质的传统蛋白质组学研究和对所有蛋白质的蛋白质组学研究之间。从局部角度研究蛋白质组的每个功能亚组。靠近活细胞的“所有蛋白质”的蛋白质组图是通过结合多个亚群逐渐绘制的。(2)蛋白质组学的产生和发展，背景，研究重点从基因组时代向后基因组时代的转移和功能基因组学的主要任务，以及基因表达研究在基因水平上的进展，但基因与蛋白质的相关系数仅为0.4 0.5。蛋白质本身的特性很难从DNA和mRNA水平上解决。这一进展得到了各国政府的支持。国际知名的研究和商业组织已经加入进来：澳大利亚于1996年建立了世界上第一个蛋白质组研究中心(APAF)，国家癌症研究所(NCI)投资1000万美元建立了肺、直肠、乳腺和卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。NCI和美国食品和药物管理局投资数百万美元建立不同癌症阶段的蛋白质组数据库。英国已经建立了三个蛋白质组研究中心，对已经完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。Celera公司投资数亿美元，开始对人体组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体进行全面识别和分类，并构建新一代蛋白质表达数据库。第一次国际“蛋白质组学”会议于1997年举行，第二次国际蛋白质组学会议于1998年在旧金山举行，应用蛋白质组学会议于1999年1月在伦敦举行。中国也于1998年开始蛋白质组学研究，并在中国科学院上海生物化学研究所举办了两次全国蛋白质组学研讨会。中国人类蛋白质组学组织成立于2003年。第一、二、三届中国蛋白质组学学术会议分别于2003年9月、2004年8月和2005年8月举行。第三届国际蛋白质组学会议于2004年10月在中国北京举行。科技部已将蛋白质组学研究纳入中国973和863计划。中国国家自然科学基金也将“蛋白质组研究”列为重点项目。中国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌的蛋白质组学研究方面取得了很大进展。第二节蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究更加复杂和困难：蛋白质的数量大大超过基因的数量。蛋白质随着时间和空间而变化。发展高通量、高灵敏度和高精度的研究技术平台是目前乃至相当长一段时间内蛋白质组学研究的主要任务。目前，主要任务是：1。蛋白质组表达模式的研究方法。蛋白质组组分支持技术的研究主要包括双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术和生物信息学分析。表达谱：(1)对于蛋白质组学研究中的样品制备，蛋白质组学分析通常可以通过使用细胞或组织中的全部蛋白质组分来进行。也可以进行样品预分类，即细胞或组织中的所有蛋白质被分成不同的部分并分别研究。样品预分类的主要方法，蛋白质溶解性：蛋白质定位如可溶性蛋白质和不溶性蛋白质；蛋白质细胞器定位如膜蛋白和核蛋白：线粒体、高尔基体、叶绿体等。样品预分类的主要功能是提高低丰度蛋白质的装载量和检测灵敏度。组织水平蛋白质组样品的制备，临床样品与各种细胞或组织混合，且状态不同，如肿瘤中的癌上皮细胞总是与血管、基质细胞等混合。激光捕获显微切割(LCM)可以直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定细胞或细胞群。(2)蛋白质组学研究中的样品分离，双向凝胶电泳(2-DE):一种利用蛋白质的等电点和分子量并结合凝胶化学特性来分离各种蛋白质的方法。原则上，第一方向是在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF)，然后在第一垂直方向进行第二方向的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。它最初是由奥法雷尔等人于1975年创建的。特点是，能分离10 10100kD分子量的蛋白质，灵敏度高，分辨率高，适合计算机图像分析处理和质谱分析匹配，最早的IEF电泳，传统的奥法雷尔系统二维电泳的缺陷。Bjellgvist等人发展和完善了固相pH梯度等电聚焦技术，Grg等人成功地将其应用于双向电泳。电聚焦、固相酸碱度梯度等优点，克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的酸碱度梯度，可以自由和准确地设定。特别是，第二次分析可以在窄的酸碱度范围内进行，因此大大提高了分辨率和可重复性。双向电泳技术的缺点，如极酸、极碱性蛋白、疏水性蛋白、极大蛋白、极小蛋白和低丰度蛋白，用该技术很难有效分离。凝胶中的酶水解过程费时费力，很难与质谱联用实现自动化。新的非凝胶技术液相色谱液相毛细管电泳液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser解吸/电离飞行时间质谱，MALDI-TOFS)电喷雾质谱，电喷雾质谱(ESI-MS)，主要质谱类型，蛋白质路线的识别和注释，通过肽质谱指纹图谱(PMF)和数据库搜索匹配，检测样品中某些肽段的二级质谱信息或氨基酸序列标签，并与数据库搜索、目录、仪器、MALDI-TOF质谱仪匹配：灵敏度高(高达fmol)，分析速度快，谱图简单数据库中肽质谱指纹图谱匹配不成功的可能原因包括样本太少、PMF图谱的信噪比太低以及输入数据库中搜索的数据质量差。从2-DE胶中提取的蛋白质斑点不是单一的蛋白质，所获得的PMF图实际上是两种以上蛋白质的混合图。在手术过程中，角蛋白或其他蛋白的污染蛋白经历了更多的翻译后修饰。数据库中没有记录表明所用胰蛋白酶的质量不够好，并且含有许多未知蛋白酶自酶解片段的新蛋白质数据库的大小太小。组织切片或打印原位质谱(MALDI-TOF/TOF)傅里叶变换回旋共振质谱(FTMS)表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)，结合精确鉴定蛋白质的技术、(4)生物信息学对于蛋白质组学研究来说，生物信息学是蛋白质组学研究不可或缺的一部分。双向凝胶电泳图谱数据库的构建与分析蛋白质组数据库的搜索与构建与应用是蛋白质组研究水平的标志和基础。瑞士PROT拥有目前世界上最大和最多样化的蛋白质组数据库。目前，最常用的数据库是NRDB数据库和dbEST数据库。由美国国家生物技术信息中心(NCBI)和欧洲生物信息学研究所(EBI)联合编辑的数据库包括许多生物的表达序列标签、肽序列标签或最适合搜索的部分序列信息。概念：对基因组中表达的所有蛋白质或复杂系统中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定。(5)定量蛋白质组学研究中，低丰度蛋白质检测困难蛋白质表达差异很小，如低于50%，准确定量成为瓶颈蛋白质表达瞬时变化，蛋白质定量困难，1。基于双向凝胶电泳定量蛋白质组学的研究策略，双向凝胶电泳(2-DE)是目前分离和展示大量蛋白质和进行蛋白质定量分析的唯一途径。荧光差异显示二维电泳(2D-DIGE)，2。基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略，原理：对于具有相同电离能力的蛋白质或多肽，可以通过比较质谱峰的强度(或峰面积)来获得待比较的蛋白质的相对量。蛋白质组功能模型的研究方法揭示了蛋白质组成员之间的相互作用和协调，深刻理解了蛋白质结构和功能之间的关系，以及基因结构和蛋白质结构和功能之间的关系。主要研究目标：(1)蛋白质翻译后修饰的研究，(2)翻译后修饰，(3)检测糖基化、乙酰化、甲基化、羧化、二硫键和修饰肽的高灵敏度方法，(4)蛋白质翻译后修饰的定量分析，(5)在适当的修饰条件下确定处理和电离条件所涉及的工作量巨大，研究面临困难：(2)蛋白质相互作用研究技术。生命的基本过程是不同功能蛋白质在时间和空间上有序和协同的代谢。蛋白质复合物或多蛋白质网络可以实现细胞信号转导、病原体感染和免疫应答。1989年，Field和宋等人设计了一种分析酵母细胞中蛋白质相互作用的方法。基于真核转录激活因子的结构和活性特征。，1。酵母双杂交系统中，转录激活因子GAL4、含NLS的N-末端和含GAL1转录激活结构域的C-末端与酵母GAL1基因启动子的上游激活序列(UASG)的特征是功能独立和相互依赖的。只有当它们以某种方式结合在一起时，它们才能具有完整的转录因子活性。构建了该系统，并分别构建了含GAL4BD和AD的酵母融合蛋白表达载体。建立含有特殊基因型的适合双杂交分析的酵母菌株的主要特点和优势是将蛋白质表型和基因型联系起来，在cDNA文库中筛选蛋白质间的相互作用。cDNA文库的真正反应不需要分离靶蛋白。缺点是：1 .假阳性结果2。假阳性结果3。仅限于在细胞核中表达的蛋白质的相互作用。2.噬菌体展示。三个基本因素：将外源基因编码的待筛选蛋白插入噬菌体p和p衣壳蛋白的N端，形成融合蛋白并在噬菌体颗粒表面表达。同时，它所保持的外源蛋白的天然构象可以被相应的抗体或受体识别。使用固体支持物上的抗体或受体，通过亲和筛选从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的靶噬菌体。外源多肽或蛋白在噬菌体表面表达，其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。它主要用于筛选与特定抗体或受体相互作用的蛋白质，研究抗体或受体的结合位点，构建随机肽库、抗体库和蛋白质库，修饰和改善蛋白质的生物学和免疫学特性，研究新的多肽药物、疫苗和抗体，研究蛋白质-核酸相互作用的生物学过程和研究新的基因治疗指导系统，具有主要优势。细菌外的高选择性亲和纯化反应的高效率不需要知道筛选的分子结构、缺点，并且外源蛋白不能正确折叠或修饰融合蛋白，这限制了肽段大小，可能影响蛋白本身的活性。3.一种基于质谱的蛋白质相互作用研究方法，质谱鉴定纯化的蛋白质复合物，用于从目标蛋白质制备蛋白质复合物，基本步骤：(1)亲和层析耦合质谱技术，基本原理：通过共价键将某种蛋白质固定在底物(如琼脂糖)上，使含有与蛋白质相互作用的蛋白质的细胞裂解物通过柱；首先用低盐溶液洗脱未结合的蛋白质，用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合到柱上的蛋白质，最后通过多维液相色谱耦合质谱(MDLC-电喷雾质谱-质谱/质谱)鉴定目标蛋白质的结合蛋白质。先决条件，获得足够的重组靶蛋白以保持作为诱饵的生物活性，以获得足够的高纯度蛋白与诱饵相互作用，使用含有靶蛋白的融合蛋白获得相互作用蛋白，谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白A融合蛋白，主要优点，高灵敏度：高浓度靶蛋白候选蛋白与靶蛋白之间的结合机会等于检测多亚基蛋白之间的相互作用，(2)免疫共沉淀耦合质谱技术， 原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体和细胞总蛋白进行免疫共沉淀(IP)纯化靶蛋白免疫复合物，