流式细胞术(FlowCytometryFCM).ppt

流式细胞术（FlowCytometry,FCM),1、流式细胞仪(FlowCytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。2、流式细胞术(FlowCytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。,基本概念,流式细胞仪结构,激光光源及光束形成系统流动室及液流驱动系统光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源，收集不同波长的荧光信号。信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补偿电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。存储、显示、分析系统：计算机。细胞分选系统,流式免疫分型技术要点,标本的获取和运输标本的制备和染色仪器的校准和质控流式细胞仪数据获取与储存,FCM的主要测定指标,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3(FL4)其中：FSC：反映细胞的大小SSC：反映细胞内颗粒性,FCM标记方法,单标：一种单抗/tube:FL1,FSC,SSC（三参数）双标：（两种单抗/tube）：FL1,FL1,FSC,SSC（四参数）三/四标：（三种单抗/tube）（四种单抗/tube）：FL1-FL3/4,FSC,SSC,荧光素种类,FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色530nmPE（藻红蛋白）：橙黄色575nmPerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色675nmPI(碘化丙啶）：橙红色620nm488nm波长的氩离子激光激发APC(别藻兰蛋白）：红色660nm630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发,PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广biotin-avidin不适合弱抗原的检测,抗体的选择,数据显示方式,单参数直方图双参数二维点图等高图二维密度图三维图,流式常见图形(HistogramPlot),流式细胞的主要信息:Fluorescence,FL1FL2FL3FL4,最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原结合,流式常见图形(HistogramPlot),适用于：单参数分析,流式常见图形(DotPlot),适用于：多参数分析,第二节流式细胞术的科研应用,分析群体细胞所需时间短多参数分析定性或定量,流式应用常见范围,细胞大小细胞的颗粒度细胞表面分子：CD系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：P53细胞功能检测：细胞周期、凋亡,抗体标记的方法,抗体的选择,首选直接标记抗体荧光分子PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原间接标记：适用范围广,biotin-avidin不适合弱抗原的检测,实验对照的设计,空白对照：ALL阴性对照：常用同型抗体对照单色分析：设同型抗体对照多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）阳性对照：检测阴性时,空白对照和阴性对照的比较：,实验标本的处理,单细胞悬液的制备：胰酶消化抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应非特异结合的去除：洗涤和封闭封闭：血清和同型抗体,流式检测应用实例,凋亡细胞内分子检测,凋亡检测-每一步都有检测试剂盒,细胞周期,G1,M,G2,S,Quiescentcells,G0,细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞Sub-G0/G1peaks-PIstaining,Caspases,AnnexinVAssay建议用于悬浮细胞,AnnexinVAssay能够区分死亡与凋亡,流式“TUNEL”,IntracellularCytokine-Protocol,SORTING（细胞分选）,DIMERXantigenspecificTcellassaymethodformonitoringcellularresponse,CBA(CytometricBeadArray),TraditionalAnalysis-Percentpositive,DeterminationoftheCD4PEABConlymphocytes,第三节流式细胞术的临床应用,白血病免疫分型HLA-B27:强直性脊柱炎淋巴细胞亚群造血干细胞计数：造血干细胞移植网织红细胞PNH诊断（CD55、CD59）血小板活化试验,流式细胞白血病免疫分型,流式细胞的免疫分型,是白血病分型的重要指标FAB标准，形态学和免疫表型结合适合于白血病的分型诊断，但不适合用于确诊是不是白血病。Minimalresidualdiseases(MRD),FCM应用,1、细胞增殖周期测定和DNA倍体分析2、凋亡检测3、免疫功能的检测4、血液学应用5、HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。6、其他：溶液中细胞因子的测量。7、细胞分选,细胞增殖周期测定和DNA倍体分析,1）细胞增殖周期：分为G0、G1、S、G2、M期。S期是DNA合成期，在S期内，DNA进行复制，使细胞的DNA含量由2倍体（2C46条染色体）变为4倍体（4C）。G1和G2期为DNA合成前、后间期，此期无DNA的合成，但RNA和蛋白质进行合成。M期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为2个细胞。细胞内的92条染色体分裂成2组46条染色体，使每个细胞内具有46条染色体。在M期分裂成两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C。M期以后部分细胞进入G1期，继续进行增殖，部分细胞进入G0期，即静止期，不再继续增殖。因此，FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正态分布。,2）利用DNA的荧光染料，如PI（Propidiumiodide碘化丙啶），与细胞内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。采用DNA直方图显示。具有2CDNA含量细胞为G0/G1期细胞，4CDNA含量细胞为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间的细胞为S期细胞。,3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量的变化。用DNA指数（DI）表示。DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人淋巴细胞G0/G1期DNA含量以正常人淋巴细胞作为对照。正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数1，为超2倍体，1为亚2倍体，两者可统称为非整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体肿瘤中出现频率较高。,第四节凋亡检测,1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影响结果的准确性。可参看文章：,2）DNA链损伤“TUNEL”法3）Annexin-V-FITC/PI双染法4）线粒体细胞膜电位的检测5）凋亡相关基因的检测免疫标记法检测基因,第五节免疫功能的检测,（1）利用多参数流式细胞术，对PB中淋巴细胞比例，及淋巴细胞中T、B、NK细胞的比例，及T细胞亚群进行检测。如CD3+（总T细胞）；CD19+（总B细胞），CD3-/（CD16+5（NK细胞）。3+/CD4+（Th/Ti）：辅助/诱导；CD3+/CD4+/CD5RA+：nave辅助/诱导T细胞；CD3+/CD4+/CD45R0+：记忆性辅助/诱导T细胞；D3+/CD8+（Ts/Tc）：抑制/杀伤；CD3+/CD8/45RA+：nave抑制/杀伤T细胞；CD3+/CD8+/CD45R0+：记忆性抑制/杀伤T细胞。胞内细胞因子的检测：CD4+/IL-4+，Th1细胞，CD4+/IFN-+。（2）临床应用：原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。,第六节FCM在血液学中的应用,1）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前对白血病和淋巴瘤的诊断，国际上提出MIC分型，即通过形态（M）、免疫分型（I）、细胞遗传学（C）检测，对白血病和淋巴瘤进行综合诊断，免疫分型是重要的检测项目之一。现在多应用多参数的流式细胞术，不同抗体分别被几种荧光素标记：第一荧光（FL1）：FITC（异硫氰酸荧光素，Fluoresceinisothiocyanate），FL2：PE（藻红蛋白，Phycoerythrin）FL3：PerCP（多甲藻黄素叶绿素蛋白，peridininchlorophyllprotein），FL4：APC（别藻兰蛋白allophycocyanin,）,2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的原因为血小板破坏过多所致。,4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞或WBC上出现CD55或/和CD59的减少，可诊断为PNH。,5）网织红细胞计数6）白细胞分类计数,第七节其他应用,溶液中细胞因子的测量:利用吸附有特异性抗体的微球，与溶液中的细胞因子结合，而检测溶液中是否存在该种因子HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。,第八节细胞分选,FCM可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞中分离出来，即所谓分选(Sorting)。被测细胞的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同则决定分选的速度，分选纯度一般可达99%以上。除细胞分选外还可进行染色体分选。分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可用于基因诊断。,淋巴20-25%:T:70%,B:20%,NK:10%;单核2-6%+粒细胞:40-60%有核红:20-25%,正常BM各系细胞比率,是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等）在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中在这些不同谱系（lineage）细胞胞浆或细胞膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的生理和病理过程。八十年代在WHO和国际免疫学联合会(IUIS)组织下，将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群CD:clusterofdifferentiation/clusterdesignation,白细胞分化抗原,1.系列交叉(cross-lineage):AML表达CD2,CD192.表达不同步(asynchronous):早期与晚期抗原同时表达3.表达量异常(over-orunder-expression):4.与细胞大小不匹配(abnormallightscatterprofile):如大CD2+细胞或小CD13+细胞,AL免疫表型特点:紊乱表型,鉴别淋髓系列区分亚型双表型、杂合型Mo、M7、AUL提示细胞遗传学异常部分与预后相关MDR监测,AL免疫表型检测意义,Gating,FCM设门法,FSC/SSC:不能将淋巴、单核及幼稚细胞区分开CD45/SSC:CD45是WBC抗原,RBC.PLT为阴性。CD45在成熟细胞表达强，幼稚细胞表达弱。在淋巴，单核及粒细胞表达强度不同。优点：能将淋巴单核及幼稚细胞区分开，特异分析白血病细胞免疫表型。,正常血细胞分化发育过程中免疫标志变化特点以及白血病细胞免疫标志特点,常用各系血细胞CD抗原1、T系：CD1-CD8（CD6不用）2、B系：CD10,CD19-CD24,FMC73、髓系：CD11b,CD13-CD16,CD33,CD644、干祖：CD34,CD117,CD38,HLA-DR,正常B细胞标志,B-ALL的分型,正常T细胞标志：根据在胸腺内发育阶段分类,T-ALL的分类,正常单核细胞标志,全单核细胞标志：CD33,CD13,HLA-DR幼稚单核细胞标志：CD34,CD117成熟单核细胞标志：CD14,CD64,正常粒细胞标志,成熟粒、单核细胞主要区别,成熟粒细胞：CD33+HLA-DR-CD14-CD64+dim成熟单核细胞：CD33+HLA-DR+CD14+CD64+,诊断白血