遗传物质的分子基础.ppt

第五节遗传工程,遗传工程是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或更适合人类需求的产品的遗传学手段。广义遗传工程和狭义遗传工程广义：包括细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程等。狭义：基因工程。,一、细胞工程,在离体（invitro）条件下以细胞为基本单位，借助人工培养基，对生物细胞进行培养、繁殖，或者使其发生变异，从而改良生物品种、创造新品种、加速繁育，或利用细胞培养生产有用物质的过程。细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞器转移、生物体的克隆与规模化繁殖等。,第一个哺乳动物的克隆Dolly羊,二、酶工程,利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品。是酶学理论与化工技术相结合的新技术体系。,三、发酵工程,利用微生物与现代化工程技术相结合，工厂化生产人类需要的物质的一种技术体系。目前医用抗生素、农用抗生素绝大部分都是发酵工程产品。,四、基因工程,利用人工方法在体外（invitro）切割、拼接、重组生物的遗传物质，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改良。基因工程操作的对象是DNA分子。又称为重组DNA技术,基因工程的基本步骤：1.目的基因的分离或合成2.将目的基因与载体DNA连接，构建重组DNA分子-表达载体3.将重组DNA分子导入受体细胞，在其中扩增和表达。,重组DNA技术流程,一、工具酶1、限制性内切核酸酶限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列的磷酸二脂酶型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化限制性切割和修饰核苷酸2种功能型酶：遗传工程中应用最广泛型酶：具有特异的识别位点，识别位点是非对称的,型限制性酶的基本特性：有特异识别和切割的序列部位DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接相对的断裂所形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端）内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成，即内切酶活性和甲基化作用活性是分开的,酶切与连接,限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接,回纹序列,限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点,平齐末端,2、DNA连接酶DNA连接酶是重组DNA分子构建必不可少的工具酶，能催化DNA中相邻的3OH和5磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来,3、反转录酶反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，故又称依赖于RNA的DNA聚合酶通常用反转录酶构建cDNA文库（cDNAlibrary）,4、聚合酶链式反应(PCR)PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明,1993年诺贝尔化学奖PCR可对特定DNA片段进行扩增，且可用痕量DNA作模板，对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝PCR反应在一种混合液中进行，该混合液包括四种主要成分：两个引物（一般为20bp）、模板DNA、热稳定的DNA聚合酶（Taq酶，在95甚至更高的温度下活性稳定）和四种脱氧核苷酸。PCR反应在PCR仪上自动进行,PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤：1）变性：95，DNA双链分离成单链2）退火(复性)：55左右，引物与单链的模板DNA序列互补结合3）延伸：72左右Taq，酶通过在引物的3-OH端增加碱基的办法使引物延伸,表12-2PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系,二、载体常用载体：细菌质粒、噬菌体、病毒等。细菌人工染色体（BAC）酵母菌人工染色体（YAC）人类人工染色体（HAC）,质粒载体分子量小