食品微生物检验的质量控制.ppt

第7章微生物实验室质量控制准则,BiosecurityofLab.AccurateofExamination,钟青萍讲授,2,质量控制相关定义,质量控制：满足质量要求的操作技术和活动。外部质量控制：通过互相校准和/或检验对实验室的操作和结果所进行的控制内部质量控制：实验室内部采取的以对比分析、跟踪以及相关方法，对实验室工作的连续性控制计划。质量手册：是描述质量系统元素的文件或文件的集合。,钟青萍讲授,3,实验室要求,组织：按国家实验室认可的概念，是指一个能够承担法律责任的实体。这里所指的是实验室（微检室）内建立的质量管理的保证体系。人员房屋满足检测工作需要。设备,钟青萍讲授,4,人员要求,实验室人员的分类：管理人员、技术人员、技术支持人员等。相应岗位的人员，应具备相应的技术能力，相应的技术能力证明（证书及证件）。微生物检验室因有相应技术能力的人负责室内的技术工作。并设立质量监督员。,钟青萍讲授,5,房屋条件要求,房屋要求：具有适宜、足够宽敞、通风有良好的照明。房屋内墙面及地等应采用易于清洁的材料，保持房间清洁。房间的设置，以其开展的工作内容加以分用，设立专用房间。房间的大小还应根据从事实验人员的进入数量上加以考虑。,钟青萍讲授,6,环境设施要求,专用房间的温湿度控制与记录（样品存放室）特殊环境的微生物指标控制与记录（无菌室等）专用工作室的标准操作规程和定期的检测校准程序。（洁净室等）特殊环境中的专用设施质量控制应符合有关要求（净化工作台）,钟青萍讲授,7,环境设施的相关技术指标,净化室、净化工作区域、洁净环境按国家及部颁标准进行检测。空气洁净度指标：检测频率及检测方法。一次/月；空气细菌检测（沉降法）。,钟青萍讲授,8,设备/仪器要求总则,满足开展相关检测项目的要求。制定相关设备/仪器的作业指导书。设备/仪器的检定校准，特别是新购仪器的检定。分别以送检、送校、自检、自校表示其所检定的状态。设备/仪器的运行检查计划。设备/仪器的运行状况及适用记录。维修后设备/仪器的再校准或检查，并具有完整的检查记录。,钟青萍讲授,9,设备控制和程序,微生物检验常用需监控的设备和仪器1.培养箱（生化培养箱或CO2培养箱等）、干燥箱、高压灭菌锅、净化工作台、pH计、冰箱（低温冰箱或冷柜），温度计、紫外灯、显微镜、离心机、天平。2.小计量容器3.微生物测定仪器、微生物检定仪器、空气采样器、酶标仪专用等。,钟青萍讲授,10,温度计,实验室必须要有工作温度计和参照温度计。工作温度计：用于日常温度检查。参照温度计：用于校正工作的温度计。温度计运行检查：一般可采用一次/半年的运行检查。日常检查、校准检查、运行检查等都应做好相应的技术记录。,钟青萍讲授,11,培养箱、水浴箱和冰箱的温度控制,根据培养物性质及温度要求，培养箱应分别设置（以用途和温度分）培养箱的温差要求，一般显示值与实测值相差不大于1，箱体内各点温差（内部的温度均衡性）以及温度波动同样不大于1。温度监控方法：可将工作温度计置甘油中，放入待测箱体内，观察工作温度计的温度，最好1-2次/天监控记录,钟青萍讲授,12,高压灭菌锅的温度控制（一）,生物指示菌法（常用）、高压灭菌锅温度计等方法进行检测。生物指示菌法是一种高压灭菌锅的效果显示法。高压灭菌锅由专人按作业指导书操作，并做好每一次的作业记录。高压灭菌锅使用时，内置物品不能太多，单位体积内的内容物（每瓶内的培养基）不能太多。同时应注意内容物不同耐受温度。总的暴露时间最好不要超过45min。,钟青萍讲授,13,高压灭菌锅的温度控制（二）,高压灭菌锅日常工作记录应包含以下信息：高压灭菌的材料、开始时间、压力/温度、取出时间、高压灭菌胶带的颜色变化高压灭菌锅温度波动范围：110，115和1212。高压灭菌锅校准周期一般在半年。,钟青萍讲授,14,干燥灭菌箱温度控制,干燥灭菌箱日常工作记录中应包括以下信息：开始的时间、到达灭菌温度时的时间、取出的时间（或关闭时间）。干燥灭菌箱的温度校准，用参考温度计进行温度测试。干燥灭菌箱温度要求与精确度：1605或1805。前者为灭菌2h，后者为30min。干燥灭菌箱校准时间一般为一年。,钟青萍讲授,15,培养基配制用蒸馏水的控制,对于蒸馏水器来说：按设备说明，定期清洁离子交换器和更换离子交换材料。检测要求：西欧标准为微生物检验用蒸馏水的特定电导率0.5ms/m；细菌数50cfu/ml。我们日常用的标准为10ms/m，未见有细菌指标。检测频率：1次/每月。蒸馏水定点供应，并做好相应的质量控制，记录检测结果。,钟青萍讲授,16,天平的管理,放置要求：无振动、无气流影响及水平台面上。天平要有使用及运行检查记录。天平作为计量仪器是列入国家强制检定的范围，一般1次/年进行检定。运行检查频率按运行计划或按产品（天平生产厂家）给出的标准重量单位进行对照。,钟青萍讲授,17,pH计,pH计使用前应用标准液进行校准。缓冲液使用有效期：pH4.00约1年pH7.00约6个月pH9.00约6个月pH计的维护：电极外表的定期清洗；电极敏感性检测及极性恢复。,钟青萍讲授,18,净化工作台的控制,水平流净化工作台工作区域，要求洁净度为100级。空气沉降30min，细菌数1个/皿。垂直流净化工作台，细菌数0.49个/皿。净化工作台运行检查频次：1次/月，主要是细菌沉降检测。净化工作台高效过滤膜一般为一年更换一次，并同时进行粒子与细菌沉降检测。,钟青萍讲授,19,紫外线灯的控制,检测方法：仪器测试法、生物测试法。仪器测试法：通过专用仪器检测紫外灯管发射的紫外光强度。国家消毒技术规范中表明在距离照射1米处，要求其强度为90。生物测试法：采用一定的菌培养物，经一定比例稀释，菌量控制在200-250个/0.5ml，涂布平板在紫外灯光下照射，2min，同时设置普通光源的对照组，后置3748h，计算其杀灭率。要求杀灭率达99%。,钟青萍讲授,20,显微镜的控制,显微镜应制定作业指导书，日常维护记录及自校记录。显微镜应置于无振动，避免灰尘，防潮等要求的环境。,钟青萍讲授,21,其它微生物检测专用仪器的控制,细菌鉴定仪、酶标仪等设备，工作中常用阳性对照检测其功能的正常性。仪器的检定按有关的部门检定或按自校作业指导书进行。仪器的使用登记、校准计划、校准记录等文件存档。仪器专人使用、操作者应取得相应的岗位培训合格，持证上岗。,钟青萍讲授,22,培养基质量控制,培养基的分类按其成分分类：有天然培养基和合成培养基。按用途分类：基础培养基、增菌培养基、选择性培养基、鉴别培养基及厌氧培养基等。按培养基的形态分类：液体培养基、半固体培养基及固体培养基。根据培养基的剂型不同分类：新鲜配制培养基和干燥培养基两种。,钟青萍讲授,23,检验中常用的培养基,水质检测用培养基：7种化妆品检验用培养基：8种食品检验用培养基：常用的有37种，110种被列入了GB4789中，其中生化试验培养基23种，一般和专用培养基89种。食品、化妆品及涉水产品等产品微生物检验常规项目中所用的增菌分离培养基有所不同，对于菌种鉴定所用的培养基，各类产品分离的菌种其鉴定所用的培养基基本相同。,钟青萍讲授,24,常用培养基的质量控制（一）,检验项目与方法：对新批号的干燥培养基物理、化学及生物学指标鉴定A.感官（外观）研细程度和颜色（溶解前后），透明度，杂质等；B.pH测定，按各种培养基要求的pH0.2，蒸馏水的pH应在6.4-7.0之间。,钟青萍讲授,25,常用培养基的质量控制（二）,C.生物学指标检定：被检培养基相应细菌生长率测试，菌落大小及特征的检测。生长率测试：适用于液体和固体培养基：将菌培养液，用生理盐水做倍比稀释，取合适稀释度进行平板计数或接种被检的培养基试管，同时以按相关的培养基国标配方新鲜配制的培养基进行对照。不低于10%。菌落大小测试：划线分离测试菌，取10个菌落测量直径大小，其直径均值与新鲜配制的培养基无统计学差异。,钟青萍讲授,26,常用培养基检定用标准菌株,甲型副伤寒沙门菌伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门茵鸭沙门茵鼠伤寒沙门氏菌痢疾志贺菌1型福氏志贺菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌普通变形杆菌肺炎克雷伯菌肺炎亚种弗劳地枸橼酸杆菌绿脓杆菌副溶血性弧菌,钟青萍讲授,27,常用培养基质量标准,干粉颜色：淡黄色粉末或呈现本培养基特有的颜色溶解后培养基色泽：清晰透明（含琼脂除外），淡黄色或特有的色泽；灭菌后的培养基pH：7.22为多；个别弧菌检验用培养基pH值偏高为：8.02生物学指标：菌落特征及菌落大小。,钟青萍讲授,28,培养基保存环境,制成的培养基保存环境为4冰箱，如制成平板则用塑料袋包装置冰箱保存。干燥培养基干粉含有活性物质、遇热易分解的物质应仔细查看存放条件，多数也须放在2-8条件保存。有的培养基则以存放于10-15条件为易。如含有高浓度胆盐的培养基。,钟青萍讲授,29,培养基的配制程序（一）,不同的培养基配制的程序有所不同，但一般培养基配制程序主要有以下7个步骤：调配、融化、矫正pH、澄清过滤、分装、灭菌及鉴定。注意点：配制时注意各类成分的用途。pH测定：干燥培养基在工厂生产时，对培养基pH进行了一定的调试，在实际工作中，由于配制的环境、配制所用的溶剂（蒸馏水）pH等条件有所不同，都会对所用的培养基pH要有所影响。因此对于干燥培养基配制，同样需要进行pH测定。,钟青萍讲授,30,培养基的配制程序（二）,配制好的培养基（尤其是糖发酵管）不宜久放。因为培养培养基吸收空气中的二氧化碳，会使培养基变酸，从而影响细菌的生长。培养基中的抑制剂及指示剂一定要精确称量，抑制剂要注意合理配伍。,钟青萍讲授,31,培养基原料及相关试剂的质量控制,配制培养基的主要原料有蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、胆盐、无机盐和琼脂等，其优劣直接影响到培养基的质量，由此也将影响检验质量。培养基相关试剂的质量控制及阴、阳性对照菌株试验。对做生化反应的各类试剂，在配就后均应进行各项必要的鉴定。用已知阴、阳性菌株进行对照试验。对于其它如氧化酶、触酶、染色液等也同样需要经鉴定后用于试验。,钟青萍讲授,32,不合格培养基可能的原因（一）,干燥培养基结块培养基过于陈旧培养基处于潮湿环境中培养基生产时水分过高pH偏离规定值培养基过于陈旧配制时所使用的蒸馏水非中性培养基过度灭菌,钟青萍讲授,33,不合格培养基可能的原因（二）,培养基不清澈使用了劣质水培养基pH值不对使用了不同的容器制备生产原料精度不够培养基过度灭菌凝固温度过高培养基干粉用的太多琼脂质量发生了变化,钟青萍讲授,34,不合格培养基可能的原因（三）,凝胶强度过低培养基干粉用的太少培养基未完全溶解培养基过度灭菌倾注前未振摇培养基瓶琼脂粉凝固强度较低颜色不对pH不正确（带指示剂的培养基）培养基过度灭菌使用了不洁的容器制备,钟青萍讲授,35,不合格培养基可能的原因（四）,培养基被污染培养基灭菌不彻底灭菌后存放不当而污染实验时使用了污染的器皿生长不良可能由制备容器设备、水或样品带入抑制物样品中含有亚致死性损伤的微生物pH不正确添加物（抑制剂）等浓度不当培养基过度灭菌实验时培养基或溶解样品时温度过高,钟青萍讲授,36,不合格培养基可能的原因（五）,过分生长培养基过度灭菌，选择性物质受到了破坏添加物浓度不当菌落蔓延琼脂表面过湿使用了过多的接种体积培养基过度灭菌非典型生长培养基制备不当干燥培养基存放陈旧制备成的培养基存放时间过长生长条件不当（温度、时间、气体）,钟青萍讲授,37,检测质量保证,定期使用有证标准物质和次级标准物质（参考物质）进行内部质量控制。实验室间的比对或能力验证利用相同或不同方法进行重复检测对留存的样品进行在检测。,钟青萍讲授,38,微生物检验质控方法（一）,菌落计数精密度控制直接计数选择同一标本，要求检验人员进行菌落计数。将大肠杆菌（25922）或经检定标化的菌片，通过合适的梯度稀释，选择合适的稀释度进行菌落计数实验操作。361培养24h进行菌落计数。,钟青萍讲授,39,微生物检验质控方法（二）,菌落计数精密度控制重复计数法选择十个平板，每个平板具有合适的菌落数（100以内）。将平板编号，由实验人员进行计数并记录结果。去掉平板编号，将平板置冰箱保存过夜，次日取出，重新给予编号，由实验人员重复计数并记录。要求：自身同一平皿重复计数误差小于7.7%实验人员之间同一平皿重复计数误差18.2%自身同一梯度平行加样两皿间相对误小于7.7%实验人员之间同一梯度计数误差18.2%范围不同梯度间菌落计数最终误差小于7.7%,钟青萍讲授,40,菌种鉴定质控,菌种鉴定质控要求，对所给的微生物菌种，按有关的方法及指标进行生化、血清等方面的鉴定。鉴定质量评价：鉴定程序是否正确；鉴定方法是否正确；具体操作技术是否熟练，结果报告是否正确。每一项设立分值为25分。总分为100分。,钟青萍讲授,41,Goonplease,钟青萍讲授,42,生物安全实验室,感染性微生物的危险度等级分类生物安全实验室生物安全柜,钟青萍讲授,43,感染性微生物的危险度等级分类,危险度1级(无或极低的个体和群体危险)：不太可能引起人或动物致病的微生物食源微生物中细菌总数、大肠菌群、粪大肠菌群等指标菌列为危险度1级。,钟青萍讲授,44,感染性微生物的危险度等级分类,危险度2级(个体危险中度,群体危险低):病原体能够对人体或动物致病,但对实验室工作人员、社区、牲畜或环境不易导致严重危害。实验室暴露也许会引起严重感染，但对感染有有效的预防和治疗措施，并且疾病传播的危险有限。沙门氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉、赭曲霉、轮状病毒等列为危险度2级,钟青萍讲授,45,感染性微生物的危险度等级分类,危险度3级(个体危险高,群体危险低)病原体通常能引起人或动物的严重疾病，但一般不会发生感染个体向其他个体的传播，并且对感染有有效的预防和治疗措施。肉毒梭菌、炭疽芽孢杆菌、肝炎病毒等列为危险度3级,钟青萍讲授,46,感染性微生物的危险度等级分类,危险度4级（高度的个体和群体的危险均高）病原体通常能引起人或动物的严重疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播，对感染一般没有有效的预防和治疗措施。鼠疫耶尔森氏菌等列为危险度4级,钟青萍讲授,47,实验室,基础实验室：一级生物安全水平基础实验室：二级生物安全水平防护实验室：三级生物安全水平最高防护实验室：四级生物安全水平,钟青萍讲授,48,钟青萍讲授,49,1.基础实验室,超净工作台,无菌操作,钟青萍讲授,50,无菌室（接种室）,钟青萍讲授,51,1.基础实验室,处理危险度2级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有的国际通用的生物危害警告标志,二级生物安全水平,钟青萍讲授,52,二级生物安全实验室,钟青萍讲授,53,进入规定,只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。实验室的门应保持关闭。儿童不应被批准或允许进入实验室工作区域。进入动物房应当经过特别批准。与实验室工作无关的动物不得带入实验室。,钟青萍讲授,54,人员防护,在实验室工作，都必须穿着连体衣、隔离服或工作服。在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物的操作时，应戴上合适的手套。手套用完后，应先消毒再摘除，后必须洗手。在处理完感染性实验材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。为了防止眼睛或面部受到泼溅物、碰撞物或人工紫外线辐射的伤害，必须戴安全眼镜、面罩（面具）或其他防护设备。,钟青萍讲授,55,人员防护,严禁穿着实验室防护服离开实验室，（如去餐厅、咖啡厅、办公室、图书馆、休息室和卫生间）。不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内。,钟青萍讲授,56,实验室工作区,实验室应保持清洁整齐，严禁摆放和实验无关的物品。发生具有潜在危害性的材料溢出以及在每天工作结束之后，都必须清除工作台面的污染。所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃或清洁再利用之前，必须清除污染。在进行包装和运输时必须遵循国家和/或国际的相关规定。,钟青萍讲授,57,废弃物处理,用以处理潜在感染性微生物或动物组织的所有的实验室物品，在被丢弃前应考虑的主要问题有：1、是否已采取规定程序对这些物品进行了有效的清除污染或消毒？2、如果没有，他们是否以规定的方式包裹，以便就地焚烧或运送到其他有焚烧设施的地方处理？3、丢弃已清除污染的物品时，是否会对直接参与丢弃的人员，或在设施外可能接触到丢弃物的人员造成任何潜在的生物学或其他方面的危害？,钟青萍讲授,58,废弃物的种类,1、可重复或再使用，或按普通“家庭”废弃物丢弃的非污染（非感染性）废弃物。2、污染（感染性）锐器皮下注射用针头、手术刀、刀子及破碎玻璃；这些废弃物应收集在带盖的不易刺破的容器内，并按感染性物质处理3、通过高压灭菌和清洗来清除污染后重复或再使用的污染材料4、高压灭菌后丢弃的污染材料5、直接焚烧的污染材料,钟青萍讲授,59,2.防护实验室三级生物安全水平,钟青萍讲授,60,钟青萍讲授,61,操作规范,除下列修改以外，应采用一级和二级生物安全水平的基础实验室的操作规范：1、张贴在实验室入口门上的国际生物危害警告标志，应注明生物安全级别以及管理实验室出入的负责人姓名，并说明进入该区域的所有特殊条件，如免疫接种状况。2、实验室防护服必须是正面不开口的或反背式的隔离衣、清洁服、连体服、带帽的隔离衣，必要时穿着鞋套或专用鞋。前系扣式的标准实验服不适用，因为不能完全罩住前臂。实验室防护服不能在实验室外穿着，且必须在清除污染后再清洗。,钟青萍讲授,62,操作规范,3.开启各种潜在感染性物质的操作均必须在生物安全柜或其他基本防护设施中进行。4.有些实验室操作，或在进行了某些病原体的动物操作时，必须配备呼吸防护装备。,钟青萍讲授,63,3.最高防护实验室四级生物安全水平,最高防护实验室的运作应在国家或其他有关的卫生主管机构的管理下进行。,钟青萍讲授,64,操作规范,除下列修改外，应采用三级生物安全水平的操作规范：1.实行双人工作制，任何情况下严禁任何人单独在实验室内工作，这一点在防护服型四级生物安全水平实验室中工作时尤其重要。2.在进入实验室之前以及离开实验室时，要求更换全部衣服和鞋子。,钟青萍讲授,65,操作规范,3.工作人员要接受人员受伤或疾病状态下紧急撤离程序的培训。4.在四级生物安全水平的最高防护实验室中的工作人员与实验室外面的支持人员之间，必须建立常规情况和紧急情况下的联系方法。,钟青萍讲授,66,生物安全柜,生物安全柜（biologicalsafetycabinets,BSCs)是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。,钟青萍讲授,67,当操作流体和半流体，如摇动、倾注、搅拌、滴加液体、划线时等各种操作都可能产生气溶胶。肉眼无法看到直径小于5um的气溶胶及直径为5-100um的微小液滴，有可能吸入或交叉污染台面等材料。,钟青萍讲授,68,钟青萍讲授,69,级生物安全柜,钟青萍讲授,70,级生物安全柜,在应用细胞和组织培养物来进行病毒繁殖或其他培养时，未经灭菌的房间空气通过工作台面是不符合要求的。级生物安全柜在设计上不但能提供个体防护，而且能保护工作台面的物品不受房间空气的污染。级生物安全柜有四种不同的类型（分别为A1、A2、B