PCR及相关技术课件

基因体外扩增PCR技术,聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是1985年发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。,PCR技术的基本原理,类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。,PCR反应的全过程，即三步，可以被不断重复：DNA解链（变性），引物与模板相结合（退火），DNA合成（链的延伸）。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成,模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR的基本原理：变性、复性、半保留复制PCR三步曲变性9097退火4555延伸72左右,PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较。,PCR的基本原理,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数,PCR模板制备,PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。大多数用途的PCR反应中，对DNA模板的要求并不严格。首先对纯度要求不严。大量的实验数据表明存在一定量的蛋白质，或SDS等对实验过程影响不大，所以只要没有交叉污染，模板DNA的制备可以不必像克隆、酶切、连接、标记等反应所用DNA制备那样严格。其次，模板用量很低，理论上102104拷贝的模板是可满足各种要求的PCR反应。由于种种原因，准备的模板量要求达一定水平。一方面可减少由于实验操作和实验精确度方面等原因而引起的扩增失败，同时用作扩增的模板DNA量越多，由于交叉污染引起的反应失败的可能性小。,引物PCR反应引物浓度为0.10.5mol/L,引物与模板的摩尔比至少为108：1。如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。,PCR引物设计,PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。PCR反应中有两条引物，即5引物和3引物。设计引物时，通常以信息链为基准，5引物与位于待扩增片段5上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成，3引物与扩增片段3端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成。PCR反应扩增的就是这一对引物之间的DNA片段,引物设计原则可采用primier5orOligo6软件设计,引物的长度通常在1530个核苷酸之间。引物越长，特异性越高，合成的成本也越高。常见的引物长度在20个碱基左右。G/C含量引物的G/C含量一般在50左右，G/C含量高，引物容易与模板结合，但如果过高，引物和模板结合过于紧密，会影响变性。G/C含量低，引物与模板不易结合。,引物二聚体在引物中不应出现发夹结构在引物中不应出现结合位点引物与目的DNA应该只存在一个结合位点，如果有多个结合位点，扩增时会出现非特异性扩增产物。引物的3端最好以G/C结束，有利于延伸的正确进行。,问题：设计PCR上下游引物时应该注意的问题（2010南京大学考研题）,PCR引物设计总结,一对引物，与3端互补长度：1530个核苷酸碱基分布随机引物内、引物间不应有互补序列引物与非特异扩增区无同源性3端必须互补5端可游离,典型的PCR反应条件,PCR反应条件的控制（一）PCR反应的缓冲液：1050mmol/LTris-HCl缓冲液，72时pH7.2,调节反应体系的pH值，使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。,(二)镁离子浓度：1.5mmol/LTaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。在PCR反应中，Mg2+的总量应比dNTPs的浓度高。其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基因可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响TaqDNA聚合酶的活性。常用1.5mmol/L。,(三)底物浓度：20200mol/LdNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值调至7.07.5，分装小管，于-20存放，过多冻融会使dNTP产生降解。在PCR反应中，dNTPs浓度在20200mol/L,dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等摩尔数浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。,(四)TaqDNA聚合酶在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)应用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和广泛应用。,TaqDNA聚合酶在7580具有最高的聚合酶活性。7580每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55时为22个核苷酸/秒；37和22时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。,PCR中所用的一些DNA聚合酶,TaqDNA聚合酶的特性,典型的PCR循环程序,*在PCR中，为了使先前扩增而尚未完成的产物能完成扩增常进行此循环,(六)反应温度和循环次数变性温度和时间：95，30s；97，15s；94，1min退火温度和时间：4555，30s1min延伸温度和时间：72，时间因扩增片段的长度而异：1kb,1min;34kb,34min循环次数：2530次，视最初靶分子浓度而定,PCR产物的积累规律,在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。,PCR产物的积累规律示意图,PCR扩增产物的分析,PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。,凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。琼脂糖凝胶电泳：通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。,酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。,PCR的主要用途,目的基因的克隆基因的体外突变DNA和RNA的微量分析DNA序列测定基因突变分析,几种重要的PCR衍生技术,反转录PCR技术原位PCR技术实时PCR技术,逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。,逆转录-聚合酶链反应ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR,实验步骤,一、总RNA的提取二、cDNA第一链的合成三、PCR四、电泳鉴定：五、凝胶图像分析系统结果分析,注意事项,1在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；2为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；3内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、-Actin（-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；,原位PCR(In-situPCR),原位PCR是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。原位PCR结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。,做原位PCR时组织处理的要求,处理后的标本，既要保持组织，细胞的形态结构，并增加细胞膜通透性，又要充分暴露拟扩增的目的DNA或RNA，使引物、探针能有效进入胞浆中发生反应。,原位PCR实验主要的应用范围,（1）检测外源性基因片段，提高检出率，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）观察病原体在体内分布规律（3）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、癌基因片段等。（4）检测导入基因；（）遗传病基因检测如地中海贫血。,原位PCR实验的大致过程,实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细胞片上滴加PCR反应液进行扩增，覆盖并加液体石蜡后，在原位PCR仪上进行PCR循环扩增，PCR扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最后显微镜观察结果。,原位PCR的基本方法,固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。蛋白酶K消化处理：用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K。PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。杂交：PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。显微镜观察结果。,PCR和原位PCR的区别,PCR是提取细胞或组织中的DNA进行基因扩增反应，而原位PCR是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增，不但可以检测到靶DNA，而且还可以了解靶DNA存在于何种细胞中，更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。,PCR、原位杂交、原位PCR,PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。原位PCR可使扩增的特定DNA片段在分离细胞和组织切片中定位，从而弥补了PCR和原位杂交的不足。,实时定量PCR技术（Real-timeQuantitativePCR）,一、定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,实时定量PCR（Real-timeQuantitativePCR）,实时定量PCR是20世纪90年代中期发展起来的基于PCR技术的利用不同的荧光检测来给核酸定量的技术。具备了传统PCR的优点，又克服了传统PCR的许多缺点。,实时定量PCR原理,实时定量PCR是20世纪90年代中期发展起来的基于PCR技术的利用不同的荧光检测来给核酸定量的技术。具备了传统PCR的优点，又克服了传统PCR的许多缺点。1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.,几个基本概念：,（1）扩增曲线：,（2）荧光阈值：,（3）Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，,（3）Ct值：,CT值的重现性：,Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,4.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。,利用荧光染料SYBRGreen可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA，但不能