DNA重组技术的基本工具课件

设想一,能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？,能否让细菌“吐出”蚕丝？,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？,设想三,经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程。,1973年，美国科学家科恩将两种不同来源的DNA分子进行体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的表达，创立了定向改造生物的新技术基因工程。,专题1基因工程,1.1DNA重组技术的基本工具,科技探索之路基础理论和技术的发展催生了基因工程,从科技探索之路中可以看出：说明没有的研究成果，没有的创新发明，基因工程不可能诞生，也不可能迅速崛起。,阅读选修3现代生物科技专题的目录，找出现代生物科技包括哪些工程？,基因工程、蛋白质工程、细胞工程、胚胎工程、生态工程,基础理论,技术,什么叫基因工程？,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。,一、基因工程的概念,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,新生物类型和生物产品,剪切,拼接,导入,表达,基因重组（定向）,它是一种按照人们愿望，定向改造生物遗传特性的技术。在DNA分子水平上进行操作。是在体外进行的人为的基因重组。一旦成功，便可遗传。主要技术是体外DNA重组技术和转基因技术。,基因工程的特点：,转基因抗虫棉,抗虫棉,普通棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,关键步骤一：,关键步骤二：,关键步骤三：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,形成重组DNA,重组DNA导入受体(棉花)细胞,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”运载体,（一）“分子手术刀”限制性核酸内切酶,二、基因操作的工具,切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶。,这类酶主要从原核生物中分离纯化出来的，迄今为止已从近300种不同的微生物中分离出了约4000种限制酶。,（简称限制酶）,限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,T,磷酸二酯键,A,A,A,T,T,G,C,C,T,T,A,A,G,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的。,4000种。,1、来源：,2、种类：,3、作用：,4、结果：,形成两种末端,（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,黏性末端,平末端,能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR）能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,限制酶,限制酶,什么叫黏性末端？,当限制酶在它识别的中心轴线两侧将DNA两条链切开时，切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,DNA分子经限制性核酸内切酶切割产生的DNA片段末端通常有哪两种形式？,有黏性末端和平末端两种。,那么，在中心轴线两侧的双链DNA上的碱基有什么特点呢？,不管是产生黏性末端还是平末端，在中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是旋转对称的。,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端。,是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就形成了重组的DNA分子了?,实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。,一种限制酶只能识别和切断特定的核苷酸序列，这是由限制酶的性质（专一性或特异性）决定的。,思考：限制酶所识别的序列有什么特点？,限制酶所识别的序列，都可以找到一条中心轴线，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是旋转对称的。,限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？,问题探讨：,限制酶从哪里寻找？,提示：联想以前学过的内容噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？原核生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？,是因为微生物在长期进化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵,将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子,是靠DNA连接酶来完成的。,1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两条DNA链连接起来的酶，称之DNA连接酶。,根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coliDNA连接酶;另一类是从T4噬菌体中分离出来的,称为T4DNA连接酶。,这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别：,E.coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,1、种类：,两类,磷酸二酯键,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,2、作用部位：,基因工程中所用的连接酶有两种：一种是EcoliDNA连接酶。另一种是T4DNA连接酶。这两种连接酶都是连接双链DNA的缺口，不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键，那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？,不是。,DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。DNA聚合酶是以DNA一条链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的子链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。,二者虽然化学本质都是蛋白质，但组成和性质各不相同。,外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？,导入过程需要运输工具载体。,载体的作用有哪些？,作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。作用二：利用载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,用什么方法才能将外源基因（目的基因）送入受体细胞中呢？,质粒是基因工程最常用的载体。,最常用的质粒是大肠杆菌质粒。,质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小双链环状DNA分子。,质粒DNA上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。,携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。,质粒DNA上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨卞青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。,在基因工程使用的载体除质粒外，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等。,它们来源不同，在大小、结构、复制以及插入片段大小上也有很大差别。,这些基因工程载体的作用，就相当于一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”。,将外源基因送入受体细胞。,1、作用：,2、条件：,能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。具有某些标记基因，便于进行筛选。载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害。载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作。,3、常用种类：,质粒、噬菌体衍生物和一些动植物病毒。,（三）基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,1.重组DNA不能复制，就可能丢失。2.没有一个至多个限制酶的切割位点，就不能进行DNA的重组。3.载体上没有没有标记基因，我们用肉眼又看不到载体是否真正进入，鉴定困难。4.载体必须对细胞无害。不能有害于受体细胞，影响其生命活动的正常进行。,原因：,大肠杆菌的质粒：,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中含有标记基因，如四环素抗性基因、氨卞青霉素的抗性基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有影响，能在宿主细胞内进行复制。,质粒的特点,1、细菌拟核DNA分子外能自主复制的小型环状DNA分子；2、质粒的存在对宿主细胞无影响；3、质粒能在宿主细胞内进行复制。,能够在宿主细胞内复制并稳定地保存。必需有一个至多个限制酶的切割位点，便于目的基因插入其中。必需带有标记基因，以便于重组DNA的鉴定和选择（或筛选）。,所有的质粒都可以作为基因工程的载体呢？,质粒的存在对宿主细胞没有影响。大小应适合，以便提取和在体外进行操作。,实际上天然质粒并不完全具备上述条件，要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补配对；每个DNA分子中每条链都存在一个G