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第五章,分子生物学研究法,本章主要内容,一、重组DNA技术发展史上的重大事件二、基因操作的主要技术原理三、基因克隆的载体系统四、基因的分离与鉴定,一、重组DNA技术发展史上的重大事件,1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；3.50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。重组DNA技术历史上的主要事件,基因工程的主要内容或步骤:,1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,二、基因操作的主要技术原理,1核酸的凝胶电泳将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。,2核酸的分子杂交技术,在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地吸印转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。,3细菌的转化,所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（CompetentCells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。对绝大多数hsdR-，hsdM-突变体菌株（k12），每ugDNA可得107-108个转化子。,4、分子克隆技术,（1）高质量mRNA的制备应用PromegaPolyATtractmRNAIsolationSystem分离Poly(A)RNA。将BiotinylatedOligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-BiotinylatedOligo(dT)-mRNA。,（2）反转录成cDNA可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶（Reversetranscriptase）；应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA的方向性。,(一)、限制性核酸内切酶的概念核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3，5磷酸二酯键，将核酸链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信息的稳定,这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。,三.限制性核酸内切酶,按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为Hind、Hind和Hind。,(二)限制性核酸内切酶的命名,按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类：类限制性核酸内切酶由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。类限制性核酸内切酶与类酶相似，是多亚蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。类限制性核酸内切酶只由一条肽链构成，仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指类酶而言,(三)限制性核酸内切酶的分类,(四)限制性核酸内切酶的作用,大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5磷酸基和3羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种不同的情况：产生3突出粘性末端（cohesiveend）:以Eoor为例：5GAATTC35GpOHTTAAC33CATAAG5EooP3CTTAAOHpG5,产生5突出的粘性末端：以Pst为例：5CTGCAG35CTGCApOHG33GACGTC5Pst3GOHpACGTC5产生平末端（bluntend）:Nru为例：5TCGCGA35TCGpOHCGA33AGCGCT5Nru3AGCOhpGCT5,DNA重组技术中最常用的工具酶,四PCR技术,PCR技术简史PCR的基本原理PCR的种类PCR的特点PCR技术的应用,聚合酶链式反应技术,PCR(PolymeraseChainreaction)聚合酶链式反应,是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,故又称为基因的体外扩增法.,可以在试管内建立反应,经数小时后,就能将极微量的目的基因或特定的DNA片段扩增数十万乃至数千万倍.无须通过烦琐费时的基因克隆程序便可获得足够的精确的DNA拷贝,因此有人也将之称为无细胞基因克隆法.,PCR的最早设想,核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。,(一)PCR技术简史,PCR的实现,1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。,PCR的改进与完善,1988年，Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在70反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。,(二)PCR技术的基本原理,类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的子链.链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。,模板DNA链,DNA的变性与复性,3,5,DNA的变性与复性,每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+,引物：PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。循环次数:循环次数决定了PCR的扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,PCR的反应体系与反应条件,标准的PCR反应体系：10扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200mol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5ulMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul,(三)PCR的种类,1单一PCR检测,例：,巢式聚合酶链反应(nPCR)也称套式PCR。在这种技术中，首先用一对外引物进行第一轮PCR，然后再使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式PCR。引物设计的方法是，巢式PCR两个引物的起始点分别从目的基因的5端碱基序列和3端的互补碱基序列向中间略有缩进；半巢式PCR只是其中的一个引物缩进。在第二轮扩增产物中，能够产生错误扩增产物的可能性是极低的，所以应用巢式和半巢式PCR技术能够使靶DNA序列得到有效选择性扩增，大大提高了扩增的灵敏性和特异性。在一定情况下，这种方法对减少扩增产物的污染问题极为有用，但同时也增加了每次试验的复杂性。为了经济节约可在第二轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第一轮扩增共用，效果也优于单次扩增。,2巢式和半巢式PCR,巢式和半巢式PCR检测,3多重PCR检测单一PCR的快速、简便和敏感是人所共知的，然而它存在的问题包括反应失败所致的假阴性和污染所致的假阳性。为了监测PCR的失败和假象，我们可以在PCR中使用一对以上的引物进行PCR扩增，即多重PCR。多重PCR的目的是同时扩增目的DNA中的几个片段，以节省模板DNA、时间并且减少费用.,多重PCR检测,引物在基因组中的位置及其序列,UlisA：5-GCTACAGCTGGGATTGCGT-3LisB：5-TTATACGCGACCGAAGCCAA-3MonoA：5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3LisB：5-TTATACGCGACCGAAGCCAA-3HA1：5-GCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAA-3HA2：5-GCAACGTATCCTCCAGAGTGATCG-3,三重PCR扩增结果,4随机引物PCR(RAPD),随机引物扩增DNA多态性分析是采用随机选择的单一引物，通过PCR扩增即能产生复杂的基因组指纹图谱的一种DNA多态性分析技术。该技术分别由Welsh和Williams于1990年同时建立。具有自身独特的优点：使用随机引物，合成引物时无需预知被研究生物的基因组序列；造作简便快速，避免了其它DNA多态性分析所需的一系列预备性工作，如筛选探针、制备克隆、多态性筛选、同位素标记和Southern印迹等；RAPD分析所需DNA量少，每个反应只需要几十个纳克的模板DNA；每个RAPD标志就相当于一个序列位点，因而这种方法可以使基因型的检测自动化，可以更有效地进行遗传图谱构建。,RAPD,5实时PCR检测实时PCR(realtimePCR)有时也称动力学PCR。最早的实时PCR仪是用一台荧光计与一台PCR仪相连构成，测量由于荧光染料分子的插入或与双链DNA分子相结合所导致扩增产物的不同荧光强度。在PCR的指数增长阶段，每个循环合成产物的产量以一种类似几何级数方式增长。因此，扩增DNA的产量可以通过反应管染料中发射出来荧光的数量来估算。因为荧光检测法的高灵敏度，实时PCR能够测量靶DNA的起始浓度相差在5-6个数量级的大范围。在应用荧光染料如SYBRGreenI时，可检测出起始样品中拷贝数为的10-100模板DNA。目前，三种最通用的实时PCR仪器是GeneAmp5700序列检测系统、ABI光谱7700序列检测系统和LightCylcler。实时PCR的主要优点在于，在一种巨大的动力学范围内测量核酸分子浓度的能力，并且以它的高灵敏度与大容量的并行操作为特征，能同时检测许多样品。与传统的PCR产物终点测量法不同，实时PCR提供关于PCR动力学的瞬间信息；因此，在不同样品之间扩增效率的差异能够通过计算获得补偿。,实时PCR检测,(四)PCR的特点,(五)PCR技术的应用,Bubert：根据iap基因属的共性和种的特异性设计引物，鉴别各种李斯特菌Bansal：检测350多份食品样品的LM，没有一例假阳性Karpskova：2000年从