核酸分子杂交-2013课件

1,核酸分子杂交,NucleicAcidHybridization,2,1.Basicprincipleofnucleicacidhybridization2.Basicmethodofnucleicacidhybridization3.BiochipTechnology4.Preparation(2)G:C对含量40%-60%；(3)探针内避免互补；(4)避免同一碱基连续出现；(5)与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。,67,(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同;(2)特异性强、本底低、重复性好；(3)操作简单、节时；(4)安全、无环境污染。,二、标记物,1、一个理想的标记物应满足：,68,2、标记物的种类,32P、35S、3H、125I等,半抗原：生物素（biotin）、地高辛（Dig）荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明等酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等化学发光探针：增强鲁米诺发光体系、吖啶类化合物发光体系和碱性磷酸酶催化的1，2-二氧环己烷发光体系,非核素标记物,核素标记物,69,体内标记,体外标记,化学法,酶法,三、标记方法,缺口平移法随机引物标记法PCR标记法末端标记法,70,利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团（如磷酸基团）发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。,化学法：,71,酶法：,OH,5,5,3,32P-dATP,生物素-dUTPorNTP,地高辛-dUTPorNTP,荧光素-dNTP,72,DNaseI,5,5,3,3,5,5,3,3,DNA聚合酶5-3外切酶活力,5,5,3,3,DNA聚合酶5-3聚合酶活力,5,5,3,3,（一）缺口平移法,-32PdATP,73,5,3,5,5,3,3,5,3,3,5,5,3,模板,变性,合成标记,Klenow酶,（二）随机引物法,74,在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样，标记的dNTP就可在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。,5,3,5,3,底物,引物,模板,（三）PCR标记法,75,只将标记物标记在DNA链的3末端和5末端的方法称为末端标记。,3端DNA末端标记,5端DNA末端标记,（四）末端标记法,76,3端DNA末端标记,77,T4噬菌体多苷酸激酶,5端DNA末端标记,-32PdATP,先用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5末端的磷酸基团，使其成为5-OH,78,1乙醇沉淀法,2SephadexG-50柱层析法,3微柱离心法,四、探针的纯化,79,第五节,影响核酸分子杂交的基本因素,80,核酸分子的浓度和长度：50300bp,0.10.5g,2.温度:Tm-25,3.离子强度:Na+浓度约为1mol/L,4.杂交液中的甲酰胺:50%甲酰胺,降低Tm,5.核酸分子的复杂性,6.非特异性杂交反应:封闭,影响杂交的因素,81,常用封闭物：变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA，小牛胸腺DNA高分子化合物：Denhardt溶液脱脂奶粉BSA,Tm值的估