转基因动物与生物反应器.ppt

转基因动物与生物反应器,一基因工程,基因工程技术的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA分子连接，得到重组DNA。世界上第一批重组DNA分子诞生于1972年，次年几种不同来源的DNA分子装入载体后被转入到大肠杆菌中表达，标志着基因工程正式登上历史舞台。,二转基因动物,所谓转基因动物（Transgenicanimal）是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的遗传工程动物。,转基因动物技术基础,重组DNA技术胚胎移植技术体细胞克隆技术基因定向整合技术,1980年，Gordon等人首先育成转生长素基因小鼠,显微注射纯化的DNA的方法。生长速度快24倍、体形大一倍的转基因“硕鼠”。从此转基因动物技术轰动了整个生命科学界。发表在1982年的nature杂志上。,我国状况,1989年，快速生长的转基因猪1990年，快速生长的转基因兔1991年，快速生长的转基因羊,三转基因动物的关键步骤,外源目的基因的制备外源目的基因有效的导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的以上细胞，选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系,核心技术,目前，制备转基因动物的主要方法有：基因显微注射法胚胎干细胞移植法反转录病毒感染法精子载体导入法等。,1原核期胚胎显微注射法,基本原理是：通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵（原核胚胎的原核内），利用受精卵繁殖中DNA的复制过程，将外源基因整合到DNA中，再发育成转基因动物。P258,主要步骤,目的DNA制备与纯化；动物的挑选、超排卵与取卵；DNA的注入；卵的转移；转基因动物的获得,详解,约400倍的显微镜下，用一根直径80-100微米的玻璃棒将胚胎固定，再用另一根直径1-5微米的玻璃管刺入细胞原核，把DNA溶液直接注射到原核期胚胎的一个或两个原核中。胚胎再经过1-3小时培养，证明没有裂解后，移植到受体母畜的输卵管内；也可体外培养发育到桑椹胚再进行胚胎移植。,转基因胚胎的鉴定,标记基因筛选绿色荧光蛋白基因、荧光素酶基因在荧光显微镜下观察，阳性胚胎中全部细胞发出荧光。,分子技术筛选采用胚胎切割的方法获得细胞，进行DNA提取后，采用PCR扩增、southern杂交等手段检测。,举例显微注射生产转基因羊P251258,羊的超数排卵受精卵采集显微注射胚胎移植体内发育出身、鉴定,优点,是目前最成熟的转基因动物制备方法,不足1.成功率较低,最多1%。至今未取得改进。每生产一头转基因羊或猪，大体需要注射100个单细胞胚。每生产一头转基因牛，需要注射500-1000个单细胞胚胎。,2.需要大量的受体动物,每生产一头转基因牛需要使用几百头牛做受体。,3.基因非定向整和,基因随机整和。大多数转基因动物都表现出一定生理异常。基因产品的生理功能会改变。如：生长激素受下丘脑控制，而转基因动物的生长激素却在肝脏等中表达，不受生理调节。,研究现状,转基因改变家畜经济性状的研究降温，而动物生物反应器研究成为热点。这是因为：在一些特殊组织或器官中表达外源基因对动物危害轻，而且不一定非要生产纯合动物。,2反转录病毒感染法P258。,将目的基因重组到反转录病毒载体上：（1）人为感染着床前或着床后的胚胎。（2）直接将胚胎与能释放反转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染目的。可通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中。,不足,载体容量太小，可插入的目标基因最大允许长度是8KB。不能控制转染时间。至今没有一头成功，几乎都是嵌合体。,3胚胎干细胞方法,胚胎干细胞（ES）当被注入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。将外源DNA导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移。P259。,4利用胚胎干细胞和胚胎移植技术实现转基因动物制备,从胚胎分离出胚胎干细胞，通过转录将外源基因导入细胞内，再将其转入到植入前胚胎的胚泡腔。这些带有外源基因的胚胎干细胞可嵌入宿主囊胚的内细胞团中参与胚胎发育。出生的动物其生殖系统就有可能整合上外源基因。再通过杂交繁育就可得到具有纯合目的基因的个体，即转基因动物。,5精子载体法,显微注射技术的效率很低，设备昂贵。直接用精子作为外源DNA载体的转移方法。P260,基本原理和方法,精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以直接进入精子头部，受精后就可发育成转基因动物。后来Rottman对此方法进行了改进，将外源DNA在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与DNA相互作用形成脂质体DNA复合物。这种复合体比较容易和精子细胞融合，从而进入细胞内。,主要问题,重复性不好,四转基因动物鉴定技术1聚合酶链式反应（PCR）技术,设计一对特异性引物，以组织提取的DNA为模板进行PCR扩增，通过对扩增产物进行序列分析就可以实现转基因动物的鉴定。,2斑点杂交,动物DNA的提取点于硝酸纤维素膜探针杂交放射自显影,五转基因动物技术的意义与最新进展,1优良动物育种,通过外源基因的导入达到使畜禽生长速度加快、产量（肉、蛋、奶）提高、耗料减少和品质改进的目的。,2动物模型与基因治疗,可以通过精确地失活某些基因或增强某些基因的表达来制作各种研究人类疾病的动物模型。已建立的遗传疾病转基因小鼠模型有：动脉粥状硬化、镰刀形细胞贫血症、老年痴呆症、自身免役病、淋巴系统病、皮炎和前列腺癌等。,3医药领域的应用,利用转基因动物生产人类药用蛋白等非常规畜牧产品，是目前世界上转基因动物研究的热点之一。,4异种器官移植中的应用,异种器官移植首先要克服的障碍是移植后发生的免役排斥反应。,例1：建立免役排斥相关基因转基因猪,可先将少量的人类基因注入到一至两个细胞阶段的猪胚胎中去，得到一两只会天然产生这些保护性蛋白的转基因小猪。这些特别培育的家猪的器官组织也就可以存活在人类的血液中间了。,例2：不含“排斥基因”的克隆猪,这种“基因敲除”基因克隆猪敲除了引起移植排斥反应的“祸首”一种特定基因（半乳糖苷转移酶基因），从“源头”上减少甚至消除了引起排斥反应的可能性。,美国马萨诸塞洲的Immerge生化治疗公司,特点,关闭一个受人体排斥的基因3-半乳糖转移酶（GT）基因。GT基因控制一种酶，这种酶使猪细胞表面产生一种糖类物质。当猪器官或细胞被移植给人体时，人类免役系统能识别这种酶，从而产生强烈的排斥反应，把移植来的器官或细胞视为外来异物进行攻击。,六转基因动物生物反应器,1基因工程药物回顾,1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药物的诞生。,2转基因生物反应器发展历程,细菌基因工程细胞基因工程转基因动物反应器,3分类与比较,转基因微生物（主要是细菌）生物反应器转基因植物生物反应器转基因动物生物反应器,转基因微生物,最早的转基因生物反应器是通过原核生物来表达目的基因蛋白。目前市场上的基因工程药物绝大多数是采用这一方法。微生物具有结构简单、繁殖迅速、容易培养等特点，而成为良好的转基因对象。,两大缺陷：,一是细菌等微生物本身是低等生物，构建好的哺乳动物或人类的基因导入后不能很好表达。二是即使表达了，产物往往没有活性，必须经过糖基化、羧基化等一系列修饰加工才能成为有效的药物。,转基因动物的产生,微生物基因工程菌的不足使人们打算用动植物细胞株代替工程细菌等转基因微生物。于是出现了细胞基因工程。但是该方法也存在不足之处。如：培养条件苛刻、成本高等。由此人们又想到，是否能将人类所需要的目的基因直接导入哺乳动物如鼠、兔、羊、猪等体内，使这种目的基因在哺乳动物体内表达，从而获得目的基因的产品。于是开始了转基因动物的研究。,4动物乳腺生物反应器,乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，因此不会影响到转基因动物本身的生理代谢反应。从转基因乳汁中获取目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。,原理,是将外源基因置于乳腺特异性调节序列（乳蛋白基因的启动子）之下，使之在乳腺中表达，然后通过回收乳汁获得重要价值的生物活性蛋白。,应用：转基因兔奶可治疗婴儿先天性疾病新浪科技2000年8月2日,患有庞普病的婴儿体内一种可促进糖原质代谢的酶有缺陷。荷兰研究人员培育出一种转基因兔，兔奶中表达这种酶，因此饮用这种奶可以治疗这种疾病。,经济效益,英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊乳汁中含有1-抗胰蛋白酶，它可以治疗肺气肿。每升这样的羊奶可售6000美元。,5动物血液生物反应器,目前，医用血清蛋白主要由人血提取，而有限的血液资源极大地限制了血清蛋白的生产和使用。如果利用转基因动物就可以在血液中表达人类目的基因，用于血清蛋白制备的原料。,适合：,比较适合生产人血红蛋白、抗体和生产非生物学活性的融合蛋白。这是由于有活性的蛋白或多肽（如激素、细胞分裂素、组织血纤维溶酶因子等）会进入动物血液循环系统而影响动物的健康。,七存在的问题P274,外源基因表达效率低和遗传丢失转基因技术有待改善成活率低以及有不良表现存在安全性问题其它问题,利用转基因动物其他器官生产药物,含人血清白蛋白转基因猪在鄂培育成功,用转基因动物生产医用白蛋白，是当今国际生物技术研究领域的前沿课题。湖北省农科院培育的3头转基因猪带有人的基因，并能从其肝脏内提取用于临床的人血清白蛋白，且此种猪体内人血清白蛋白含量每升高达20.3克，这是国内外同类研究的最高水平。,转基因克隆动物,最有前途的转基因动物制备技术,内涵,在细胞水平进行转基因操作检验鉴定后进行克隆。技术基础：基因定向整合与体细胞克隆技术。,优点,应用基因定向转移技术对基因进行有计划、有目的的修改，并把这种经过基因修改的细胞变成动物。获得基因修饰的细胞可以大量繁殖，克隆出一批动物，达到工厂化规模。基因转移、基因表达的检测都在细胞水平完成，不受季