第五章miRNAj简介

第五章miRNA相关研究,miRNA简介及miRNA检测,miRNA靶基因预测,基于生物信息学的miRNA靶基因功能分析,一、miRNA简介及miRNA检测,1、miRNA简介2、miRNA检测,miRNA简介,MicoRNA（miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，介导特异性的基因沉默导致靶降解及抑制蛋白质的合成调控转录后基因表达水平。最早在1993年在线虫体内发现，截至2014年7月，miRNABase收录了近3万个miRNAs，其中在人类中发现并命名的超过1万个，除了早期发现的let-7等保留命名外，一般命名为miR-数字。序列分析表明，至少有1/3的人类基因与miRNA调控相关，miRNAs参与了所有目前发现的生物活动过程。,miRNA通常位于基因间或内含子区域,核内RNA聚合酶转录,pri-miRNA,核酸酶Drosha及其辅助因子Psha,pre-miRNA,Exportin5转运,细胞质,Dicer切割,双链miRNA,降解,单链、成熟的miRNA,表达的时序性和组织特异性提示人们：miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用,miRNA的表达方式各不相同，具有：1高度的保守性、2时序性、3组织特异性、4严谨的时空表达模式,成熟miRNA,Argonaute蛋白,RISC（RNA诱导沉默复合体）,a完全互补结合切断靶基因的mRNA，作用方式和功能与siRNA相似。植物中，大部miRNA都以这种方式，靶基因mRNA断裂后,无poly(A）的分子的端加上多个u并很快降解，含poly(A）的分子能稳定存在一段时间(如拟南芥miR-171)b不完全互补结合阻遏翻译而不影响miRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类(如线虫lin-4).在植物中极少数的miRNA通过此方式来抑制靶基因c结合抑制互补结合，直接靶向切割miRNA不完全结合，起调节基因表达作用,RISC对靶基因mRNA的作用主要取决于与靶基因转录体序列互补的程度,miRNA检测,传统技术包括NorthrenBlot等基于分子杂交的方法，DNA克隆、测序。这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。反向筛选法研究Mir-16家族的功能时建立的。新一代测序miRNA的实时定量PCR，miRNA原位杂交技术以及miRNA芯片技术超敏感的高通量方法，具有快速、特异性强、另名都高等优点。,二、miRNA靶基因预测,1、生物信息学方法miRNA研究常用数据库miRNA靶点预测常用软件2、生物学实验方法从mRNA水平寻找miRNA靶基因从蛋白质水平寻找MiRNA靶基因,1、生物信息学方法,MiRNA研究常用数据库,GEOEBImiRBaseTargetScan,GEO是一个基因表达和杂交微阵列数据库，同时也是获取来自不同生物体、不同基因表达数据的在线资源。服从微阵列数据标准，捕获了充分注释的原始和处理数据，支持好几种数据存放选项和格式，包括网络格式、电子表格、XML和文本形式的简单混合格式（SOFT）。,EBI管理维护着世界最全面的分子生物数据库，例如ArrayExpress、ENA、PDBe等EBIArrayExpress是基于功能基因组学的数据库，服从微阵列数据标准和高通量测序数据规则，是一个简单的基于Web的交叉数据查询和资源下载。该数据库可查询和分析miRNA芯片的表达数据库，登录ArrayExpress，可通过生物种属、芯片、实验类型等条件筛选检索感兴趣的芯片数据,miRBasemiRNA信息数据库，收录多种动植物miRNA序列和注释。提供包括miRNA序列数据、注释、预测基因靶标等信息的全方位数据库，是储存miRNA信息最主要的公共数据库之一。,TargetScan数据库基于靶基因跨物种进化保守和miRNA靶基因二聚体热力学特征搜寻动物的microRNA靶基因,预测microRNA靶标假阳性率较低.它要求miRNA种子序列(第2到第位核苷酸)和mRNA3UTR完全互补,同时从种子序列向两翼延伸,直至遇到不能配对的碱基,此过程允许G-U配对,还引入了信噪比来评价预测结果,信噪比是用原始miRNA及随机产生(保持二核苷酸组成不变)的miRNA分别对目标UTR作预测，所预测得到的靶基因数目的比值.TargetScan后来又优化成TargetScans,TargetScans在人、小鼠、大鼠的基础上增加了狗和鸡基因组数据，同时在算法上做了改动，可查询miRNA家族及种属保守性。,miRNA靶点预测常用软件,目前生物信息学预测miRNA靶基因常规的算法主要遵循以下几个原则:miRNA与靶基因的互补性;miRNA靶位点在不同物种之间的保守性；miRNA-mRNA双链之间的热稳定性和分子自由能;miRNA靶位点不会有复杂的二级结构;miRNA端于靶基因的结合能力强于端。,生物信息学预测miRNA靶基因,都有一定的假阳性率(准确性)和假阴性率(灵敏性).两者一般是对立的,准确率很高可能导致灵敏度降低。考虑miRNA与靶基因互补序列因素的，灵敏性相对较高(假阴性率低,即实际上是靶点但没有预测到的可能性低),但准确性低(假阳性率高，即预测到的靶基因实际上是没有作用的)。如果同时考虑其他因素,，预测的假阳性率就会有一定程度的降低，但同时也会漏掉一些结合位点,降低灵敏性。一般来说，取几个预测软件的共同靶基因有助于增加miRNA靶点预测阳性结果的概率，可能提高miRNA靶基因寻找的准确性，但同时也会降低灵敏性；反之，取各个软件预测靶基因的并集则会降低灵敏性而增加预测的假阳性率。,2、生物实验学方法,1、生物学实验方法从mRNA水平寻找miRNA靶基因miRNA靶基因大规模寻找miRNA靶基因的精确查找从蛋白质水平寻找MiRNA靶基因2、从蛋白质水平寻找miRNA靶基因,miRNA靶基因大规模寻找,将miRNA成熟体双链或腺病毒载体转染至细胞中，使得miRNA在细胞中过表达，之后利用基因芯片分析mRNA的变化以找出相应miRNA组织特异性的靶基因。由于miRNA在体内通过翻译抑制或影响mRNA的稳定性起作用，因此这种方法在寻找起翻译抑制作用的miRNA的靶基因时存在一定困难。Beitzinger等利用AGO蛋白家族既能结合miRNA又能结合mRNA的特性，分别使用AGO-1和AGO-2蛋白的单克隆抗体在人类细胞中进行免疫共沉淀，得到与AGO-1和AGO-2蛋白结合的mRNA各600条，并通过克隆测序对这些mRNA进行鉴定。同时从与AGO-1蛋白结合的mRNA中随机挑选条进行荧光素酶报告基因检测，发现其中有条都是miRNA的靶基因。Easow等利用基因芯片分析miRNP(miRNA效应复合物)中结合的mRNA，发现大量计算机预测的miRNA靶基因得到了富集，同时对野生型果蝇和miR-1缺失果蝇的miRNP结合mRNA进行了分析，得到单个miRNA的靶基因，并利用实验方法鉴定miR-1调节的mRNA,miRNA靶基因的精确查找,在研究Mir-16家族的功能时建立的针对miRNA靶基因的反向筛选法。确定感兴趣的基因ccnd1将它的3UTR构建到荧光素酶报告载体中与构建的miRNA表达文库共转染HepG2细胞得到荧光值明显下降的miRNA将得到的miRNA在体内验证其功能得到Mir-16家族能够调节ccnd1基因关键在于利用了自行构建的miRNA表达文库，同时研究多条miRNA，通过体外实验候选miRNA进行初步筛选，从而快速鉴定一条mRNA所对应的多条miRNA。,从蛋白质水平寻找miRNA靶基因,分别将成熟miRNA双链转染Hela细胞，利用细胞培养稳定同位素标记技术，将转染了成熟miRNA双链的细胞和正常细胞分别培养于含轻/重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基中，经过若干次细胞倍增后，稳定同位素按照序列特异的方式完全掺入到新合成的蛋白质中，通过比较标记前后同一肽段的质谱峰值变化实现对蛋白质的精确定量，在检测了2000-5000个蛋白后，两个研究组分别发现，转染一条miRNA后有几百个蛋白的表达水平发生了改变，许多改变在mRNA水平上不能得到体现。,与miRNA靶基因的预测方法相比，目前还没有一个快速、简便、高通量的对miRNA靶基因进行实验验证的方法。最直接的鉴定方法是利用荧光定量PCR及Westernblot方法分别检测转染或降低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化，从而确定miRNA与靶基因的对应关系。这种方法能够直接鉴定miRNA的靶基因，准确度高但不能鉴定miRNA的靶位点。目前最为常用的miRNA靶位点鉴定方法是荧光素酶报告基因法，其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的UTR中构建到荧光素酶基因的UTR中；之后将构建好的载体转染细胞并miRNA改变细胞中相应miRNA的表达水平;最后检测荧光素酶的表达情况，以分析转染UTR中中是否含有miRNA的靶位点。,三、基于生物信息学的miRNA靶基因功能分析,GOGenMAPPGeneMANIA,GO,Geneontology作为一个成熟的生物信息学工具，GO用于描述基因及基因产物的特性，对大量基因进行有效注释和分析。GO包括以下3个独立的本体：细胞内的特定组件、组件在分子功能上所扮演的角色以及基因或蛋白质参与的生物学过程，涵盖了注释中的基本信息。AmiGO是基于web界面，为用户提供基因本体术语定义和注释数据的查询和显示服务。用户可以通过检索蛋白获得相应的术语，可以检索术语得到相应的细节和相关的蛋白注释，AmiGO还提供了BLAST搜索引擎，比对有术语注释的基因和基因产物的序列。,GenMAPP,GenMAPP对大量的基因表达数据进行可视化处理、生物途径分析。数据库(生物途径图)来源于KEGG数据库.通过GenMAPP软件分析可对任何感兴趣的生物过程进行基因差异表达分析。MAPPFinder是GenMAPP软件中具有聚类分析功能的一部分,链接GOconsortium允许用户检索任何存在的，相对于GO基因相关和GenMAPP芯片通路谱(MAPPS）的表达谱数据。分析产生的结果能够通过选择感兴趣的术语MAPPS直接以GO等级或在GenMAPP中展示出来。GenMAPP运行结果的基础上，对基因差异表达数据分析生物过程、分子功能和细胞组分进行聚类分析，并进行显著相关性统计分析。,GeneMANIA对基因与基因间关系的构建包括蛋白质与基因相互作用关系、信号通路、共表达、共定位以及蛋白结构域的相似性等。使用者将一组基因数据提交GeneMANIA后通过在线分析可获取这些基因的相互作用关系网络。形成的网络中其基因与基因间主要的关系包括:共表达（co-expression)其数据来源于GEO;物理相互作用(physica