EC呼吸代谢改变和ROS生成减少文献翻译终稿

CELLFOOD提高内皮细胞呼吸代谢并抑制缺氧诱导氧自由基产生【摘要】内皮细胞线粒体是产生ATP的主要部位，通过调节细胞内氧自由基的动态平衡来控制内皮功能。内皮细胞需要充足的氧供。缺氧及富氧环境都可能导致氧自由基的过量产生，从而导致氧化应激、线粒体损伤及内皮功能异常。Cellfood是一种抗氧化合剂，它能够调节携氧能力及线粒体呼吸代谢及体外实验中调节EC缺氧环境诱导的氧自由基产生。我们的实验目的是研究CELLFOOD抗氧化的功能和机制。实验使用Clarks电极来测量人类脐静脉内皮细胞和ECV-304细胞的氧气消耗量。在使用cellfood最初的几分钟内，氧气消耗量增加，同时伴有线粒体氧化能力的增强和细胞活力的增强。在EC暴露在CF八天时，我们也观察到同样的现象。氧气消耗量的增加同时伴随细胞内ATP产生增加和LDH比例的保持。通过上调Mn超氧化物歧化酶（一种保护线粒体功能的抗氧化物），CF显著地抑制了缺氧诱导氧自由基的产生。EC的缺氧应答被HIF-1a调控，HIF-1a的活性被CF减弱，伴随而来的是Mn-SOD上调。结论：CF通过改善EC呼吸代谢和促进EC的抗氧化的机制来保护内皮细胞的功能。【引言】内皮参与了很多生理反应和人类疾病，内皮细胞在疾病局部病灶的形成过程中扮演非常重要的的作用。特别是EC能够调节血管功能的稳定。所以保护内皮细胞的功能、形态和活力是非常的关键。EC对氧气非常敏感，同时它也拥有一种可以适应氧气变化的机制。EC的氧感受器非常敏感，一旦遇到缺氧环境时，EC会上调HIF-1a。线粒体作为细胞主要的能量来源，维持细胞能量平衡。内皮不是主要的能量消耗器官，例如血管内皮通常在一种休眠状态。尽管如此，EC仍有非常强大的线粒体网络，这说明了在维持EC的生理性氧气代谢和生物能量方面，线粒体起到很重要的作用。此外，EC线粒体可能参与心血管疾病的发生发展的病理生理学变化。触发内皮损伤的一个重要的启动因子是氧化应激，它是由增加的氧自由基和细胞内抗氧化活动不足所产生的一种不平衡情况引起的。尽管氧化损伤和心血管功能异常的量效关系尚未完全明确，但过量的氧自由基的产生和血管内抗氧化物质缺乏，这两种情况产生的氧化应激都是多种心血管疾病产生的共同因素这点是明确的。EC线粒体呼吸链量很小但是确是氧自由基重要的目标，可以导致线粒体不可逆损伤。除外线粒体代谢和糖酵解是EC能量代谢产生ATP的关键以外，内皮功能异常似乎首先和线粒体损伤有关。目前，将抗氧化物质直接运输到线粒体的手段有新的发展。Cellfood是一种食物来源的D2SO4结合多种矿物质、氨基酸和酶组成的有抗氧化作用的合剂。尽管配方的复杂性妨碍了我们分析那种物质是和临床疗效最有关系的成分，但是无疑整体的配方是有效地。在实验中，我们研究了CF在如下几方面的的作用和机理：对ECV304和HUVEC的线粒体功能、体外呼吸代谢、氧自由基产生、Mn超氧化物歧化酶诱导和HIF-1a途径。【材料和方法】细胞培养HUVEC是从人类脐带组织中用胶原酶分离出并培养在1%凝胶覆盖的烧瓶中（Falcon，BectonDickinson,Bedford,MA,USA)，使用无内毒素的Medium199（Biowhittaker,Cambrex BioScience,Verviers,Belgium)，含有20%热灭活胎牛血清（FBS,Hyclone,Logna,UT,USA),1%牛视网膜生长因子，90ul/ml肝素，100I.U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Biochrom,Berlin,Germany)(CM)。所有的实验都是使用HUVEC(一-四代）ECV-304内皮细胞线（AYCC）是培养在添加了10%FBS的Medium199中。缺氧处理HUVEC培养在由C-chamber控制了温度和适度的环境中（Biospherix,Redfield,NY,USA),空气的成分是1%氧气，5%CO2，90%N2。内皮细胞用Cellfood处理Cellfood（Eurodream S.r.l.,La Spezia，Italy）是含有D2SO4和17种氨基酸，34种酶和78种矿物质。在一系列实验中（短期实验），用单一剂量的1ul/mL的CF加入到EC中，在15-20分钟内测量氧气的消耗和线粒体功能。在另一实验中（长期实验），每天将逐渐增加浓度的CF加入EC中，第一到三天，加入0.3ul/mL，第四天-六天，加入0.7ul/mL，第七天-第八天加入1ul/mL。对比组EC自然生长8天。内皮细胞活力为了评价EC的活力，使用添加不同浓度的CF达到24小时的EC，用PI/AnnV试剂盒标定，然后细胞荧光仪分析（FC500-Beckman Coulter)。亮视野显微镜我们用Eclipse TS100显微镜（Nikon，Melville，NY）（10倍放大）拍摄显微照片。测量氧气消耗量我们使用改装过的Clark电极来测量。简单来说，在R中插入的圆柱体含有6层，可以提高总得表面积，每一个用玻璃圆形的盖玻片盖住（13mm），ECV(每个盖玻片上有150,000个细胞）种植。数据用Winwedge软件搜集。这一装置实验开始时候组装条件是：24%氧气（=一分子氧气溶解在1ml水中在一个大气压，37摄氏度）。每5秒测量氧气消耗量，持续到至少12分钟。数据是用基础氧气消耗速率百分比来表示。共聚焦显微镜EC放置在玻璃片上， 用或不用CF处理，用acridine orange（AO，0,67uM，10分，37度，Sigma-Aldrich，St.Louis,MI,USA)来评价细胞活力及用线粒体标记物CMXRos 衍生物（MT，100nM，45Min，37度，Molecular Probes，Eugene，OR，USA）来对线粒体染色，依据细胞膜的功能。MT如被氧化后，会减少活细胞的荧光探针。将玻片放置在共聚焦显微镜（Lecia TCS SP5,AOBS Microsystems GmbH,Wetzlar,Germany)下分析。实验重复了三次。在HUVEC中测量ATP和LDH细胞内ATP和LDH水平是是用商用的ATP冷光分析仪（Invitrogen S.rl.,San Giuliano Milanese,Milan,Italy)和LDH细胞毒性染色分析仪（LK100，Oxford 生物化学研究所，Oxford，MI，USA）测量。我们将HUVEC在6个培养皿中培养，再用沸水处理后测量细胞内的ATP。ATP和LDH标准每次都是用得出标准化曲线。用Bradford方法来测量蛋白含量。ROS测量我们通过用具有细胞弥散性的HE荧光探针（如前述）来培养HUVEC。简言之，细胞在缺氧环境中培养24小时，之后用2umol/LHE染色1小时（37度条件下），洗色后用流式细胞仪分析（FC500，Beckmancoulter）。只有活细胞才能被用来分析。免疫荧光显微镜暴露或者未暴露在缺氧环境中(1%氧气），以及在特定的间隔用（未用）CF处理的HUVEC的Mn-SOD表达，我们使用兔抗Mn-SOD（1:50，4度，隔夜，Upstate-Millipore，Milan，Italy)。HIF-1a的表达和Glut-1的表达，我们使用抗人-HIF1a抗体（clone OZ15）（Novus Biologicals)和兔抗Glut-1（来自DAKO），继而用兔抗鼠IgG Alexa Flour594。细胞核使用DAPI（Sigma-Aldrich）染色。数据分析结果用单边ANOVA分析。P0.05有统计学意义。【结论】Cellfood 提高内皮细胞呼吸代谢，保持最理想的线粒体功能。 通过预实验：24小时不断提高CF的浓度来来评价CF对HUVEC的毒性。CF只有在浓度非常高的时候才对EC有一定程度的毒性（15ul/L)；相应的，EC在我们实验所用浓度范围内（1ul/L)表现出最理想的细胞活力。并且，在这一浓度值下，HUVEC和ECV的形态、形状、大小及粘附力（活力的标志）和对照组相似。尽管EC的大部分能量是在无氧环境下产生，但它们仍然消耗氧气。线粒体功能在EC的传代细胞中得到减退，这点已被证明。所以，我们使用HUVEC在passage4以内。我们将Clark电极改装以避免EC因失去粘附力而出现的失巢凋亡现象。为了评价CF对耗氧量的影响，我们把ECV细胞在培养皿中放置几分钟。测定的数值作为基线值。加入CF之后氧气的的消耗量迅速增加，氧气百分比下降达到6%，提示CF的有效性。值得注意的是，在这些培养条件中，PH值都是稳定的（没有显示出来），说明没有酸中毒。为了证明这种行为，通过使用MT（一种线粒体活性标记物）和AO（DNA嵌入染色，是一种细胞活力标记）来表示短期实验中（15分钟内）ECV线粒体活力和细胞生命力。添加CF导致AO-MT荧光染色较未处理组更加亮，说明了线粒体有很好的活力和细胞生命力保存的很好。为了评价是否这种发现仅仅局限在ECV细胞中，我们研究了原代HUVEC细胞的线粒体活力，发现他们的活力保留时间达到15分钟，。这些发现证明CF能够很好的保存线粒体活性而不影响他们的细胞的生命力。我们同时也通过长时间使用不同剂量的CF（8天）来评价氧气的消耗量。处理组的氧气代谢较未处理组略高，在3天和8天时达到峰值。同时我们评价了CF对ECV和HUVEC线粒体活性的效果。线粒体功能在这段时间能得到保持，没有依据显示死亡或者EC的去粘附。因此我们得出结论：CF可以提高EC的呼吸代谢而不影响它的生存力（从长期来看）。Cellfood维持了ATP的产生。 我们通过不同的时间点来测定细胞内的ATP含量和未处理的HUVEC做对比，用增加和减少来表示。它的变化显示了铃状分布曲线，在短期的时间点（3h）和在8天的时间点上有非常明显的峰值。相反的，LDH的含量，在同样的区间里，3h时候有明显的下降，并保持在和对照组相似的水平上，整个过程中没有PH的下降。这些数据说明CF改善糖酵解和线粒体呼吸代谢。 Cellfood影响氧自由基产生，通过Mn-SOD表达的调节来抑制缺氧诱导HIF-1a活化。 EC是氧气变化很敏感的感受器，ROS作为自然的副产物在氧气代谢过程中持续不断的产生，缺氧环境可以刺激线粒体产生ROS。HUVEC持续不断的生成ROS，并且通过24小时连续暴露在重度缺氧环境中（1%氧气）ROS的表达升高。值得注意的是，加入CF可以显著地抑制ROS生成增加。CF是通过什么机制来实现的呢？我们通过测定Mn-SOD的表达（它是一种ROS的清除剂，保护细胞免受氧化损伤）来评价。由于细胞内部机制，暴露在缺氧环境中1h和24h的HUVEC在Mn-SOD的表达上略有不同。有趣的是，在相同的实验条件下加入CF后，能够很大程度上提高Mn-SOD的表达，非常令人信服的说明CF，通过上调抗氧化剂水平，可能对缺氧产生的氧化氧化应激发挥着重大的保护作用。EC的缺氧应答是通过活化HIF-1a来实现，它转移到细胞核导致下游基因转录。在基础培养的条件下存在HIF-1a的低水平表达，主要存在胞浆内。暴露在1%的缺氧环境后立刻诱导HIF-1a表达并传递到细胞核，在24h内降回到基线水平。值得一提的是，加入CF则可以抑制这种表达，很可能提示CF参与了HIF-1a途径。相应的作为一种缺氧适应机制Glut-1表达上调，加入CF后它的表达也得到抑制。【讨论】 内皮参与了许多生理学功能和疾病，内皮细胞功能异常是临床症状发生的危险因素，如血管疾病和中风。所以，整个心血管系统很大程度上是依靠血管内皮功能和结构的完整。保护EC稳态是非常有必要，正因为内皮损伤和功能异常的临床现象有非常明显的生物学相关性，因此非常需要抗氧化剂和需要一种可以紧密调节内皮活性的复合配方。在本文中，最近有描述过丙酸盐的重要作用，在植物纤维素中的短链脂肪酸含有此物质，它能够一直TNF-诱导的内皮的mRNA和ICAM-1和VCAM-1表达，通过抑制NF-kB p65，EC活化的另一调控因素。 内皮损伤的主要启动因子是氧化应激，它是由于ROS的产生增加（和血管内皮细胞凋亡有关）和包括酶类物质（如Mn-SOD在内）等细胞内抗氧化物质不足产生的不平衡导致。 另外，白藜芦醇对血管的氧化损伤的保护效果已被说明，因为它能够诱导HUVEC和EA.hy926内源性抗氧化酶产生。 这里，通过研究CF，一种营养合剂，它在体外对内皮细胞的氧化代谢机制影响的效果和机理，我们有如下发现：1） EC使用一次CF后会出现氧消耗量的大幅度增加，以及线粒体活性增加，而不影响EC活力。2） HUVEC重复使用CF数天（持续到8天），有理想的氧气消耗量、线粒体活性和下游产物ATP，而没有LDH堆积。 这些发现说明从糖酵解到线粒体途径，它们的代谢水平都有提高。我们的研究非常明显的证明了Cellfood在保留EC线粒体活性方面的效用。氧气消耗量增加和氧自由基产生的关系已经做过相关研究。实际上，大剂量的氧自由基的产生和不能完全的清除氧自由基，特别是超氧阴离子，会导致“氧化应激”，这也与多种心脏血管疾病的发病机制有关，包括高胆固醇血症、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病及心力衰竭。超氧阴离子的主要的抗氧化剂是SODs。SOD2是一种线粒体Mn-SOD，它位于线粒体基质中，因此我们选择它来反映有线粒体参与。在保护线粒体功能方面SOD2的主要作用是最近在缺少Mn-SOD的小鼠心衰的模型中被发现的，其内皮细胞的功能极大的损伤。图片中我们可以看到通过上调Mn-SOD（随着时间的推移，它的表达是波动的），由于缺氧诱导的ROS表达在使用了CF之后得到显著的改善。这些发现说明在缺氧导致的氧化应激反应中，CF提高了EC对氧自由基毒性的抵抗力，进而保护了他们的活力和功能。EC的缺氧诱导应答是由HIF-1a调节，它的激活了有效地的促血管生成因子的转录和下游功能获得。试验中，CF抑制了HIF-1a引起的核易位及Glut-1正调节的表达，说明CF参与了缺氧途径，可以作为一种新的内皮细胞缺氧应答的调节因子。我们推论是Cellfood是通过调节Mn-SOD活性来抑制HIF-1a，因为他们在同一HUVEC细胞株上的表达成负相关。并且过量的ROS的产生、Mn-SOD减少、HIF-1a激活三者之间的关系最近在