第十三章 分子标记及生物芯片技术与应用续.ppt

,陈全家,生物芯片,生物芯片是近年来在生命科学研究领域中崭露头角的一项新技术。它通过使用半导体工业中的微加工和微电子技术，和其它相关技术，将现在庞大的分立式生物化学分析系统缩微到半导体硅芯片中。从而具有高速度、分析自动化、和高并行处理能力。生物芯片技术大浪潮在本世纪末已成为研究HIV、癌症、新药开发、疾病诊断、基因治疗、新食品开发及生命科学的一条光辉大道，它与PCR技术相媲美，成为21世纪的主流。DNA微点阵芯片是生物芯片中最常见的一种，这一技术使点、线、面呈现在一起，它可将成千上万个的生物讯息密码储存在一片固相基质上，与电脑芯片相比被称为生物芯片。,生物芯片,生物芯片诞生的划时代意义国内外生物芯片的研究进展生物芯片研究开发的目标,生物芯片诞生的划时代意义,世界普遍认为：“21世纪将是生命科学的世纪”，“生物芯片将象计算机芯片一样成为新世纪即将来临的又一次高新科技革命的奠基石”。计算机芯片诞生给人类带来的冲击生物芯片给医学和生命科学带来的革命即将来临的国际医学网生物芯片的科学价值,计算机芯片诞生给人类带来的冲击,1946年世界上第一台电子数字计算机ENIAC在美国宾夕法尼亚大学问世1947年美国电报电话公司贝尔实验室的三位科学家巴丁、布莱顿和肖克莱研制出世界上第一只半导体晶体管（Transister）1958年美国硅谷快捷半导体公司（FairchildSemiconductorCorp.)研制出世界上第一块集成电路IC1971年英特尔公司研制出了世界上第一块将运算器和控制器集成一体的微处理器芯片1994年国际因特网问世，为人类的生活开辟了崭新的空间,生物芯片给医学和生命科学带来的革命,1991年美国Affymax公司开始研制生物芯片1992年美国Affymetrix宣告成立世界上第一个生物芯片专业制造厂家1996年Affymetrix公司的基因芯(检测p53、p450、RCA1/BRCA2等基因突变)片产品首次投放市场1998年美国Nanogen公司程京博士领导的研究小组在世界权威学术刊物NatureBiotechnology报道了世界上首例缩微生物芯片实验室1999年美国Motorola公司推出生物芯片系统2001年本世纪三大计划的最后一项计划“人类基因组计划”将在2001年提前完成,什么是生物芯片(Biochips)？,生物芯片是将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分析各种生物分子存在的量的一种技术。,生物芯片的分类,生物芯片的分类,根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。,生物芯片的分类,芯片：reversenorthern-dotblots基因芯片：检测基因突变基因表达谱芯片：检测基因表达水平蛋白质芯片：蛋白质在载体上的有序排列，依据蛋白质分子、蛋白质与核酸相互作用的原理进行杂交、检测和分析。组织芯片：从不同的组织内进行活体解剖后取出圆柱状的组织，然后包埋在受体区组内,生物芯片的分类,寡核苷酸芯片、cDNA芯片、Genomic芯片模式一：是将靶DNA固定于支持物上，适合于大量不同靶DNA的分析，模式二：将大量探针分子固定于支持物上，适合对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。,生物芯片的应用,基因表达水平的检测基因诊断药物筛选个体化医疗测序生物信息学研究,生物芯片的制作,说了那么多了，生物芯片到底怎么做呢？,生物芯片的制作,载体的材料在制作生物芯片时，载体材料很多，大致可分为四类：1无机材料2天然有机聚合物3人工合成的有机高分子聚合物4各种高分子聚合物制成的各种膜,生物芯片的制作,点样设备Telechem公司全新SpotBotPersonalMicroarrayer一台台式普通离心机大小(30cmx30cmx22cm)的个人芯片点样机功能相当完备。,生物芯片的制作,生物芯片的优点,基因芯片的最大优点在于其高通量。传统方法检测众多基因要经历多次实验而且自动化程度低，因而每次实验之间是存在系统误差的。基因芯片可以克服这个缺点，众多基因的探针的标记、杂交等过程是在一次实验过程中完成的，而且自动化程度高，数据客观可靠。,生物芯片的缺点,基因芯片的缺点在于其不能对待检测基因在多细胞类型组织中的精确定位进行判断。另外很多蛋白质调节其功能不主要是依赖其是否表达或表达量高低，而是依赖蛋白质磷酸化-去磷酸化等方式。在这种情况下，用核酸类生物芯片就没有什么意义了，正在研究开发中的蛋白类芯片可能会有所作为的。,介绍几种生物芯片的产品,生物芯片多孔反应覆膜生物芯片多孔反应覆膜可用于所有使用96孔酶标板的自动化仪器上，使生物芯片的加样，洗涤过程自动化。产品宽度与生物芯片基片（载玻片）相同，贴在基片上后，形成多个分离的小孔，可以分析多个样品。膜上孔的间距与酶标板上孔间距相同，与本公司的ChipHolder配合可以使用在所有使用96孔酶标板的自动化仪器上，使生物芯片的加样，洗涤过程自动化。,介绍几种生物芯片的产品,SCAN-I是中国科学院-中科百奥科技有限公司新近研制开发的产品，全自动检测及分析系统适用于相应波长范围内的生物芯片图像扫描和信号分析，是光、机、电、数字技术和生物学技术相结合的产物，实现了生物芯片的图像摄取、处理、分析一体化。,我国生物芯片行业发展现状,生物芯片北京国家工程研究中心（16#地、总建筑面积30224平方米位于中关村生命科学园）北京博奥生物芯片有限责任公司承建。该项目是建设生物芯片微加工相关条件、分子生物学、化学、光学等实验室分析条件及相关辅助设施，形成年产生物芯片分析系统120台、应用型生物芯片90万片的生产能力。,我国生物芯片行业发展现状,生物芯片技术在中国还是空白，而到目前，中国生物芯片的产值就达到了2亿多元人民币，生物芯片研究已经从实验室进入应用阶段。,即将来临的国际医学网,将缩微生物芯片实验室、远程手术、多语言病历档案和医疗保险登记与环球通讯系统有机地结合到一起，使人们可以在远离自己居住地的地方旅游、出差，而同时又可以随时接受医疗、保健服务。这将使我们的生活空间再次得到拓展。,生物芯片的科学价值,利用基因芯片技术，可以寻找基因与疾病的相关性可以实现对待测基因群和相关疾病的快速、准确和简便的诊断开展基因表达活性和大规模的基因变异多态性研究，可以同时监测千百个基因，甚至全部基因可对与环境污染因素相关的基因全面监测，对生态环境控制及人口健康有着十分重大的意义生物芯片技术还可不断延伸、创新，开发出相关的药物芯片、蛋白质芯片、细胞芯片等生物芯片生物芯片系统与国际医学网的结合将使远程治疗术走向实用化、大众化,国内外生物芯片的研究进展,96年以来，美国、俄罗斯、英国、德国、日本、荷兰、加拿大等国家的政府、著名公司和大学已先后投资二十多亿美元用于生物芯片的研究开发。,国内外生物芯片的研究进展,国内外生物芯片的研究进展,国内外生物芯片的研究进展,2000年3月，国务院决定：由国家计委和国家科技部直接领导、具体组织，由中央政府投入巨资(首期投资2.8亿元)，由技术优势单位：清华大学、华中科技大学、中国医学科学院、中国军事医学科学院等四家作为发起人和董事单位，联合创建了生物芯片国家工程研究中心、北京博奥生物芯片有限公司,主要承担国家级生物芯片研究开发项目。,生物芯片的本质是进行生物信号的平行分析，采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概念，通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子，可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成，从而实现对基因、配体、抗原等生物活性物质进行高效快捷的测试和分析。20世纪80年代，传统的生物实验室中手工测定十几个DNA片断的序列需要至少一天时间。目前运用价格达数十万美元的自动化DNA序列分析仪，可以在一天内测定近2000个DNA序列）。,走近生物芯片,基因芯片（Genechip）是最早出现的一种生物芯片。基因芯片是指将大量探针分子固定于支持物(substrate)上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中分子的数量。基因芯片上固定着很多的核苷酸序列，它们作为探针与样品中的目标基因杂交。探针的底部有一种荧光酶，只有当探针与目标基因发生杂交反应后才会发光。通过扫描仪将探针发出来的信号转变成可能分析的图像数据，在经过软件分析处理，就可以知道样品中被检测的目标基因是什么了。,生物芯片的一种基因芯片,基因芯片的理论基础,传统的Southernblot和Northernblot是将受检测的样本固定在尼龙膜上，再利用特定的已知探针来检测样本中是否存在互补的DNA序列。基因芯片的核心原理与Southernblot和Northernblot相同，只是相反将各种探针固化到基质上，用以检测受检样品中与各种探针互补的核酸物质的变化。,基因芯片的理论基础,基因芯片（genechip）又称DNA芯片、DNA微阵列（DNAmicroarray），它是指采用原位合成（insitusynthesis）或显微印刷技术，将数以万计的DNA探针分子固定于支持物的表面上产生的二维DNA探针阵列。基因芯片与标记的样品进行杂交后，可通过检测杂交的信号来实现对生物样品快速、高效地检测或诊断。基因芯片技术应用了三种关键技术：即微阵列制作技术、探针杂交技术和扫描分析处理技术。,基因芯片的理论基础,将大量探针分子固定于支持物(substrate)上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。,基因芯片流程,酵母整个基因组基因芯片,基因芯片的制作方法,基因芯片载体探针DNA或RNA分子生物芯片的制作方法点接触法喷墨法光刻合成法基因芯片杂交基因芯片的扫读与分析,基因芯片载体,用于制作基因芯片的载体材料可分为四类：无机材料、天然有机材料、人工合成的有机高分子聚合物以及各种高分子聚合物制成的膜。目前适合于制作基因芯片的载体材料有硅片、玻璃片、瓷片、聚丙烯膜和尼龙膜等。制作生物芯片的材料必需满足如下要求：（1）载体表面具有可进行化学反应的活性基团，便于与生物分子进行偶联。（2）载体为惰性的并有足够的稳定性。（3）单位载体结合的DNA分子能达到最佳容量。（4）载体具有良好的生物兼容性。,基因芯片载体,薄膜型如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。这种类型“芯片”的点阵是通过“点膜”形式制作的，并通过一定的方法使探针能够牢固地结合于其上，整个过程类似于斑点杂交技术（如CloneTech公司）。玻片型这种芯片的点阵是通过原位合成技术制作的，点阵密度很高，所以必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。当前具有此类产品研制能力的公司很少（如Affimetrix公司）。,微板型这种芯片实质上是一种具有高密度、小容量测试孔的小型酶联免疫检测板（如PE公司等）。,基因芯片载体,集成电路型将杂交技术与微电子技术结合于一体有目的地通过电子装置检测或控制DNA等生物大分子的作用过程（如Nanogen公司）,基因芯片载体,制作基因芯片的DNA样品主要来源于从细胞中提取的mRNA反转录后的cDNA文库。此外还利用PCR扩增技术和DNA固相合成技术获得所需要的各种基因序列。,探针DNA或RNA分子,DNA探针,ElectronicConcentrationandHybridization,DNA探针,ElectronicAddressing,DNA探针,ElectronicStringencyControl,生物芯片的制作方法,点接触法由Shalon和Brrown等建立，由点样机将DNA探针分子直接点接到载体上，该方法经济、快速，可在1cm2面积内点上3000个点探针分子，该方法的不足是每个探针分子必须预先合成好并纯化。喷墨法是通过压电晶体或其它推进方式将生物分子从微小的喷嘴喷射到载体上，喷嘴不与芯片直接接触，在1cm2面积上可喷上10000个点。光刻合成法由Fodor和Colleagues等建立，它将半导体工业中的光刻技术与DNA的化学合成方法结合起来，将光不稳定保护基团的四种DNA模块固定在玻片上，通过光脱保护，以少量的保护寡核苷酸和试剂按照设计的序列合成DNA。利用该方法合成芯片的密度和精度都比较高，能在1cm2面积合成250000组寡核苷酸探针分子。,在芯片点阵上直接合成寡核苷酸,1通过光刻掩膜曝光2去保护区域被激活3固相化合成1个碱基4通过另一个光刻掩膜曝光5引入另一个碱基6重复这一步骤,基因芯片微点阵制备系统,基因芯片杂交,分子杂交是基因芯片技术的基础。两条互补的核酸分子在一定条件下通过氢键作用而相互结合，形成双链DNA分子。当其中的一条核酸分子带有可检测的标记时，能形成特异性结合的分子就被检测出来。基因芯片中探针被有序地固定在固相支持物上，当基因芯片与带标记的待检测分子在一定条件下发生反应后，发生特异性结合的探针位置就被确定，根据探针分子的种类就可确定待测样品中是否含有某种特异的分子。在进行分子杂交前须对靶DNA分子进行扩增以提高反应的灵敏度，然后对靶DNA进行标记。样品的标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。,分子杂交系统,基因芯片自动杂交仪,基因芯片的扫读与分析,基因芯片杂交后必须用扫读装置将芯片的反应结果转变为可供分析处理的图像数据，该扫读装置就是芯片扫描仪。目前商业化的芯片扫描仪有激光共聚焦芯片扫描仪、CCD芯片扫描仪等。在获得图像数据后借助计算机对结果进行分析和处理。,高密度微点阵检测扫描系统,基因芯片荧光侦测仪,基因芯片的扫读与分析,对生物芯片扫描数据的采集、处理、分析和报告是生物芯片技术中的一个重要环节，它由复杂的计算机来完成。生物芯片是在一块载体上集成了数千或数万个点的识别分子，每个点相对应于一段特异的核苷酸序列和杂交测定的光密度值。对芯片数据处理包括芯片图像分析和数据的提取、芯片数据统计学分析和生物学分析等。扫描得到的图像文件已经是数字文件，但还没有得到各样品点的光密度值、面积和光密度比等数据，必须通过图像处理提取各样品点的数据。扫描获得的信号包括样品信号和背景信号。,图象分析系统,高密度微点阵分析软件,生物芯片对未来生活的影响,生物芯片的应用正处在迅速发展中，并将在生活和生产的各个方面发挥越来越重要的作用。比如：芯片测序、基因图谱绘制、基因表达分析、克隆选择、基因突变检测、遗传病和肿瘤诊断、微生物菌种鉴定及治病机制、药物研究、农林业、军事医学等。,那么，具体有哪一些应用呢？,科学体检,不久的将来，传统繁复的身体检查可能将被基因芯片全面取代。在操作中，只要在人体上取一滴血，放到拇指甲大小的一块芯片上，便可以由计算机迅速自动诊断出被检者是否患有遗传病，以及其他可能存在的遗传缺陷，预测到你未来若干年的健康回收到哪些威胁，以便采取相应的对策加以预防。,芯片基因检测的推广将更有效的降低出生缺陷的发生率。利用这种芯片对育龄男女及3个月以上的胎儿进行检测，能够准确、快速地检测出被测对象是否带有乙肝病毒、丙肝病毒和艾滋病。,自测健康,一分钟取血样，两分钟检测，三分钟出诊断结果！听起来就像是神化一样。然而有了生物芯片，这个神话就将变成现实，将来任何人随时随地都能自测健康状况，这就是它的神奇之处。,检测时，只需把血液滴在芯片上，其中的疾病基因就会和芯片上对应的基因发生化学反应而结合，用特制的电脑扫描仪已进行扫描后，计算机很快就能识别发生反应的是哪一种疾病的基因，从而判断被检测者是患了哪种病。,个性化治疗,基因芯片能查出人与人的遗传基因的特性。这意味着将不再对所有患者采用千篇一律的治疗方法，而是针对个人，分别投以最有效的治疗药物或方法。通过基因芯片人们可以快速获得基因表达模型的变化，获知哪些基因、哪些蛋白参与了哪些疾病。