高中生物同步课件：6.2 DNA片段的扩增——PCR技术(中图版选修1).ppt

第2节DNA片段的扩增PCR技术,学习导航1.理解PCR扩增DNA片段的原理。重点2.尝试PCR技术的基本操作和应用。难点,一、DNA在细胞内的复制1.所需的酶：_酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。2.引物：_。3.原料：_。4.原则：_。,DNA解旋,一段RNA,四种脱氧核苷酸,碱基互补配对原则,二、PCR及其过程1.概念：PCR即聚合酶链式反应，实际上是在_模拟细胞内的_，形成大量_的DNA片段。,体外,DNA复制过程,特异性,2.过程,DNA模板,氢键,一对引物,DNA聚合,脱氧核苷酸,判一判(1)细胞内DNA复制和PCR技术所需的引物一样，都是RNA。()(2)经PCR技术合成的DNA分子中，每条单链都含有引物。()(3)PCR实验的原理和操作都十分复杂，不易于操作。()(4)经过高温变性、低温复性和中温延伸三步操作，DNA片段可呈指数增长。(),三、实验操作1.准备(1)为了避免_等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行_。(2)如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为_、_和_，然后按要求在3个水浴锅中来回转移PCR的微量离心管即可。,外源DNA,高压灭菌,95,55,72,PCR热循环,260nm,想一想决定PCR反应特异性的原因有哪些？【提示】待扩增DNA片段的特异性。,要点一PCR技术与体内DNA复制的比较,特别提醒PCR反应需要可变的温度，而体内DNA复制需要稳定的温度。DNA解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开；DNA聚合酶的作用是将单个脱氧核苷酸加到已有的单链片段的3端上，需要模板;DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。,PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是()PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNAPCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制,ABCD【解析】PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA，长度通常为1540个核苷酸。PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。【答案】C,变式训练(2012成都七中高二检测)下列关于DNA复制和PCR的描述中，正确的是()ADNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链BDNA复制不需要引物C引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合DPCR扩增的对象是氨基酸序列,解析：选C。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链，故DNA复制需要引物，而且它与DNA母链通过碱基互补配对结合。PCR扩增的对象是DNA，而不是氨基酸。,2.PCR扩增过程,图示：,3.DNA扩增数目的理论计算理论上DNA扩增呈指数增长。若只有一条DNA模板，则复制n次后有2n条；若一开始有m条DNA模板，则复制n次后有m2n条；实际操作过程中，由于无关变量的影响，一般来说实验值要略小于理论值。,近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内,将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。,(1)加热使DNA双链间的_键完全打开，称为_；而在细胞中是在_酶的作用下进行的。,(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入_种特定的引物。当温度降低至55C时，引物与两条“舒展”的模板的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的_端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是_。,(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的_和_，前者由_自动调控，后者则靠_来维持。(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是_。,【解析】(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为变性，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤:变性(95)、复性(55)、延伸(72)，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。,由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。(3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲液)，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。(4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。,【答案】(1)氢变性解旋(2)两3从子链的5端向3端延伸(3)温度酸碱度PCR仪缓冲液(4)1/8,互动探究(1)PCR中由碱基错配而引起哪种变异？(2)假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配，则扩增若干次后检测所用DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占多少？【提示】(1)基因突变。(2)50%。,【误区警示】关于DNA的扩增方向容易发生混淆，为了明确表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(OH)末端称为3端，磷酸基团的末端称为5端，子链从引物3端开始延伸，而子链的合成方向是从5端向3端延伸。,要点三实验操作与结果分析1.检测PCR扩增效果的过程,2.结果分析DNA片段的扩增是否成功的判断(1)对于电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。(2)扩增不成功的可能原因有：漏加了PCR的反应成分；各反应成分的用量不当；PCR程序设置不当等。,在PCR扩增DNA的实验中，预计一分子DNA经过30次循环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210个DNA分子，那么不是出现该现象的原因是()ATaqDNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制B系统设计欠妥C循环次数不够D复性时，部分亲链与亲链结合,【解析】如果TaqDNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制，则导致催化效率降低，得到的产物比预期的少。如果PCR系统设置不妥，达不到预期的结果。复性时，模板链既可以和引物结合，互补的模板链