实验五 根系活力的测定

实验5根活性的测定一.意义根系具有吸收养分、水分、支持植物和合成有机物的能力。它是农作物赖以生存的基础。根系和地上部分的生长是密切相关和相互依存的。只有当根系生长良好时，地上部分器官才能相应地旺盛。因此，研究根系活力对于了解作物根系营养，提高作物根系吸收养分和水分的能力具有重要的现实意义。在科学研究中，根系呼吸强度、阳离子交换量(CEC)、有色物质的吸附和三磷酸腺苷酶活性常被作为作物根系活性的指标。二、确定原则和方法(a)根表面积的测定1.亚甲蓝吸附法(1)原理：根据植物根系吸收矿质营养的理论，根系对溶质的初始吸收具有吸附特性。假设在吸收过程中，吸收物质的单层均匀地覆盖在根系的表面上，根的吸收面积可以根据根系对物质的吸收量来确定。亚甲基蓝(C16H18H3SCl)通常用作吸附物质，并且已知1毫克亚甲基蓝单体层占据1.1平方米的面积。因此，根的总吸收面积可以根据溶液被吸收前后的浓度变化通过比色法精确测定。当根系在溶液中达到饱和并保持在溶液中时，根系的活性部分可以将吸附在根表面的亚甲基蓝吸收到细胞中并继续吸附亚甲基蓝。因此，根系的有效吸收面积可由后一吸收量获得。(2)方法：(1)取出完整的根系(注意保持根尖和细根)，仔细清洁根面上的沙粒和土壤颗粒，冲洗后用吸水纸除去根面上的水分。(2)将根放入量筒(试管或试管)，慢慢加水至一定刻度，取出根，等待水从根流入容器，用滴定管准确加水至刻度，加水即为根的总体积，并记录。(3)根据根系总体积，吸取0.0002 N甲基丙烯蓝溶液(每升溶液含64 mg甲基丙烯蓝)，吸取量约为根系总体积的10倍，分别放入3个1、2、3号的小烧杯中，准确记录每杯溶液的毫升数。(4)取大量根系，用吸水纸小心吸收根系表面的水分，避免损伤根系，并在每个杯中依次浸入装有烯丙基蓝溶液的小烧杯中1.5分钟。请注意，每次取出时，你应该使烯丙基蓝溶液从根部表面流回原来的烧杯中。(5)从三个烧杯中各取1毫升溶液，放入校准试管中，稀释至10倍，用光电比色计测量其在660纳米波长下的光密度，根据标准曲线，计算每杯用根系浸泡后溶液中剩余的甲基丙烯蓝毫克数。(3)结果计算：总吸收面积(m2)=(cl-c11) v1 (C2-c2l) v2 1.1有效吸收面积(m2)=(C3- C31) V3 1.1有效吸收面积(%)=有效吸收面积(cm3)/根体积cm3(注意):加入氯、C2、碳1、2和3烧杯，烯丙基蓝溶液的浓度用烧杯Cl1、C21、C311、2和3浸泡根后亚甲蓝溶液的浓度加入烧杯V1、V2、V31、2和3中的亚甲蓝溶液量(毫升)。(4)仪器试剂和标准溶液的制备：(1)校准试管或量筒。 50毫升小烧杯：3光电比色计：一台 0.0002N亚甲蓝溶液：准确称取0.0640克亚甲蓝，放入烧杯中加水溶解，然后转移至1000毫升容量瓶中，加水定容。亚甲蓝标准溶液：吸取15.6毫升0.0002牛顿亚甲蓝溶液，放入100毫升容量瓶中，加水至刻度，摇匀。该溶液每毫升含有0.000毫克亚甲蓝。取7个有刻度的试管并编号。依次吸取0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0毫升该溶液。分别加水10毫升，相当于0.000升、0.002、0.004、0.006、0.0008、0.010毫克亚甲基(1)原理：当将干燥的植物根浸入溶液中，然后捞出表面的溶液并干燥时，一些溶液会吸附在根的表面，溶液的重量会减轻。硝酸钙是经过研究选择的最理想的物质，因为它是一种中等分子(分子量64.1)，极易溶于水。当硝酸钙和水以633，601的比例混合成溶液时，它们容易吸附在根系的表面上，因此根系吸附的量可以通过重量差减法获得，以表示根系的表面积。(2)方法步骤：(1)冲洗植物的根系，风干后备用。(2)将6份的硝酸钙加入到1份的水中，轻微加热使其溶解，制成61的硝酸钙H2O溶液，以备后用。(3)根据根系的大小在烧杯中取一定量的上述溶液，充分保证根系全部浸没，放在天平或台秤上，记录其重量(G0)。(4)将风干的根系浸泡在溶液中10秒，然后取出根系并停留在烧杯上方30秒，将表面的多余溶液倒入烧杯中，并记录其重量(G1)。两个重量之差g=G0-G1表示根系吸收的量，即根系表面积的大小。(3)仪器和试剂(1)天平或平台秤：一个。(2)镊子：一对(3)烧杯(4)玻璃棒钙(NO3)2溶液根活性的测定L.-萘胺法(1)原理：-萘胺被根系氧化与其呼吸强度密切相关。据研究，根表面对-萘胺的氧化是由过氧化物酶催化的，过氧化物酶将部分根表面染成红色。反应如下：因此，根的活性可以通过测量与根接触一段时间后溶液中未氧化的-萘胺的含量来确定。溶液中未氧化的-萘胺在酸性环境下与对氨基苯磺酸和亚硝酸根反应生成红色偶氮染料。-萘胺的含量可用比色法测定。反应如下：(2)方法(1)取出完整的根系，仔细清洗，然后用吸水纸从根系吸水，称取新鲜根系l- 2.0g，放入100ml三角瓶中，加入40ppm萘胺溶液和50ml磷酸盐缓冲液，轻轻摇动。(2)静置5-10分钟，根部快速吸附完成，从瓶中取出2 ml溶液，放入20 ml刻度试管中，以此时刻为零点，将剩余溶液塞入瓶塞，置于25摇床上，摇匀3-6小时。(3)振荡完成后，从瓶中吸取2 ml溶液，并将其放入另一个20ml刻度试管中。(4)在上述步骤中，由于萘胺溶液会自动氧化，在同样的操作下还必须做无根空白试验。(5)将蒸馏水10毫升加入上述二次试验和空白试验所取的2毫升测量溶液中，混合均匀后，加入1毫升人1%对氨基苯磺酸和1毫升10ppm亚硝酸钠溶液，混合均匀，置于室温(显色温度20-25，时间5分钟)，然后加入蒸馏水，定容至20毫升。在510 nm波长20-60分钟内比色，记录光密度，从标准曲线上找出-萘胺含量。(3)结果计算：-萘胺的总氧化量=第一次吸取溶液的测定值(g/ml)-第二次吸取溶液的设定值 24 ml-萘胺自发氧化量=(空白试验第一次吸出物测定值(g/ml)-空白试验第二次吸出物淹没值) 24 ml-萘胺的完全氧化(g)-萘胺的自发氧化(g)反应时间鲜根重量(根活力)(ugh-1gFW-1)-萘胺的生物氧化强度=仪器试剂和-萘胺标准溶液的制备三角瓶：100毫升2刻度试管：20ml2移液管：2 ml 1，10ml 1，1ml 2振荡器光电比色计：一台40 ppm-萘胺溶液：精确称量0.1000克分析纯-萘胺，并将其溶解在50毫升蒸馏水中(轻微加热)。冷却后，溶液应保持100毫升的恒定体积，即l000PPm。应储存在棕色瓶中，低温避光保存，使用前稀释25倍，即40 ppm溶液。 l%磺胺酸溶液：称取lg磺胺酸，溶于100ml 30%中磷酸缓冲液(酸碱度=7)。用11.876克纯Na2HPO42H2O称量液体A，并将其溶解在1000毫升蒸馏水中。液体B以纯KH2PO4 9.078g克称重，并溶解在1000毫升蒸馏水中。两种溶液A和B以633，604的比例混合。-萘胺标准溶液的制备：使用40 ppm-萘胺溶液，制备40、30、20、15、5 ppm标准溶液。另取20毫升校准试管6个，编号1-5个，试管中各加入不同浓度的萘胺标准溶液1毫升，磷酸盐缓冲液1毫升，在第6个试管中，加入蒸馏水1毫升，磷酸盐缓冲液1毫升，作为对照试管。然后向每个试管中加入10毫升蒸馏水、1毫升1%磺胺酸和1毫升100 ppm亚硝酸钠溶液，并将其混合均匀。在室温下放置5分钟显色，然后加入蒸馏水定容至20毫升，摇匀，在20-60分钟内比较510纳米波长的颜色，在参比管的光密度为零的情况下读取各管的光密度，并绘制标准曲线。2.氯化三苯基四唑(TTC)法(1)原理：CNZ (TTC)是一种氧化还原物质，标准氧化还原电位为80mV。溶于水时为无色溶液，但还原后产生不溶于水的三苯基甲基。生成的装甲是稳定的红色，不会被空气中的氧气自动氧化。因此，它被广泛用作酶试验的氢受体。添加琥珀酸、富马酸和苹果酸可以增强植物根引起的TTC还原，并被丙二酸和碘乙酸严重抑制。因此，它可以测量琥珀酸脱氢酶的活性。酶的活性表明了根系的活性。(2)方法步骤：(1) TTC标准曲线制作：吸收0.2毫升0.5% TTC标准溶液，放入10毫升量瓶，加入少量Na 2SO 4粉末，摇匀产生红色指甲，加入10毫升乙酸乙酯，摇匀。然后分别取0.25、0.50、1.00、1.50、2.00毫升液体，放入10毫升容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，得TTC 0.025、0.05；使用0.10、0.15、0.20毫克的标准比色系列作为参考，在485纳米处测量光学密度，光学直径为1厘米，并绘制标准曲线。(2)称取0.5g样品，放入称量瓶中，加入l0ml等量的0.4%TTC溶液和0.1M磷酸缓冲液的混合溶液，将根部充分浸泡在溶液中，在37下保温1小时，然后加入2ml 1M硫酸终止反应。(3)取出根，用粗滤纸吸水，放入研钵中，加入少量石英砂和乙酸乙酯研磨成浸膏A，将红色乙酸乙酯浸膏移入10ml容量瓶中，用少量乙酸乙酯将残渣洗至白色，最后用乙酸乙酯定容至10ml，用空白试验(先加入硫酸，再加入根样品， 其他程序同上)作为对照，在分光光度计上测量光密度(波长485nm ),检查标准曲线，并计算TTC减少量。结果计算：TTC还原强度=TTC减量(g)根量(g)时间(小时)(3)仪器和试剂：分光光度计。分析天平(托盘天平)4厘米漏斗：l迫击炮：一套量筒：10毫升1刻度移液器：0.5毫升，5毫升2，2毫升3。容量瓶：10毫升高称量瓶(3060毫米):2。乙酸乙酯(分析纯)连二亚硫酸