杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白

Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白,蛋白组吴召慧211-5-10,主要内容：,1.杆状病毒表达载体系统简介2.基本原理3.主要操作流程,1：杆状病毒表达载体系统简介,杆状病毒表达系统（Baculovirusexpressionvectorsystem，BEVS）是利用携带有外源目的基因的重组杆状病毒作载体，在昆虫体内或其培养细胞内进行表达的一个重组蛋白生产系统。杆状病毒表达载体系统的建立和发展,被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展，现已成为基因工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。,杆状病毒表达载体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus，AcMNPV）表达系统和家蚕核型多角体病毒（Bombyxmorinuclearpolyhedrosisivirus,BmNPV）表达系统。杆状病毒科分为包含体病毒亚科（Eubaculovirinae）和非包含体病毒亚科（Nudibaculovirinae），包含体病毒亚科分为核型多角体病毒属（NPV）和颗粒体病毒属（GV）,杆状病毒表达系统的优缺点,优点对外源基因容量大适合表达细胞毒性蛋白安全性且表达产量高后加工过程完全可以同时表达多个外源基因体内表达缺点瞬时表达糖基化简单,2：基本原理,1：目的基因插入转移载体。2：目的基因转移到病毒基因组靶位点，空斑纯化获得重组病毒。3：重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。4：纯化目的蛋白,杆状病毒表达载体的构建,转移载体通常由三部分组成：E.coli质粒的复制原点和抗生素抗性基因（如Ampr），保证转移载体能在大肠杆菌中扩增。含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子，在该启动子下插入要表达的外源基因。启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒DNA序列，用于与野生病毒DNA同源重组。,直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困难，为纯化常采用下列方法：,(1)在外源基因的前端插入6His，表达的融合蛋白可通过Ni柱进行亲和层析纯化。(2)将谷胱甘肽转移酶基因（GST）导入外源基因前端，利用GST能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白。(3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达，该蛋白与生物素具有非常高的结合能力，可以对表达产物进行纯化。,BactoBac系统重组病毒的构建和基因的表达,3：主要操作流程,DH10Bactem.coli感受态细胞的制备,转化DH10Bactem.coli,提取重组病毒,Sf9细胞转染，复制重组病毒,生产重组蛋白,DH10Bactem.coli感受态细胞的制备,1.取3mlLB液体培养基至15ml无菌离心管，加入3l50mg/ml卡那霉素（kan）和6ll5mg/ml四环素(tet)混匀；2.接种DH10BACTME.coli菌种至上述LB培养基中，37,200rpm培养14-16h；3.按1:100取1ml过夜培养的DH10BACTME.coli菌液至100ml新鲜LB液体培养基【加100lkan（50mg/ml）和200ltet（5mg/ml四环素）】，37,220rpm，约2h，至OD=0.4-0.6；4.上述细菌液转移至50ml无菌离心管,冰浴20min，每5min摇动一次，同时冰浴上0.1MMgSO4,0.1MCaCl2+15%甘油；,5.细菌液4，4500rpm，离心5min，弃上清；6.加10ml0.1MMgSO4重悬菌体，冰浴20min；74，4500rpm，离心5min，弃上清；8.加10ml0.1MCaCl2+15%甘油，重悬；9.200l每管分装至1.5mltube管（-80预冷），-80保存。,转化DH10BACTME.coli,1.冰上融化DH10BACTME.coli感受态细胞（约5min）；2.取1ngpFastbac-重组质粒至DH10BACTME.coli感受态细胞轻弹两下混匀，冰上静置30min；3.42热击45秒；立即转移至冰上冰浴2min；4.加800l室温预热的LB培养基，37,220rpm，4h；5.涂布至LB琼脂平板（含Kan,Tet,Gen）,6.挑取白色菌落接种至5mLLB液体培养基（抗生素如上），37培养过夜。7.保种，提重组质粒,重组病毒的提取(试剂盒）,1用1.5ml离心管收集1-5ml菌液。12,000rpm离心1min，弃上清。2加入250l溶液/RNaseA混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。3加入250l溶液，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。4加入300l溶液，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。,512,000rpm室温离心15min，收集上清。6加入800ul异丙醇，混匀至有沉淀出现。712,000rpm室温，离心15min，弃上清。8加入800ulbufferw2洗涤,12,000rpm室温离心1min，弃滤液。重复洗涤一次。9室温或风干DNA，加入50-80ulEluent溶液，冰上溶解10min，4保存。,Sf9细胞转染,137预热Sf900TM-IIISFM培养基；2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a溶解5l纯化的杆状病毒重组质粒于100lSf900TM-IIISFM培养基；b转染试剂充分摇匀后取8l加入100lSf900TM-IIISFM培养基，混匀；c将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min；,3Sf9细胞计数,取6孔板，每孔加入1.6106个细胞(其中一孔设为空白对照)，补加预热的Sf900TM-IIISFM培养基至2ml，混匀，室温静置15min，使细胞贴壁；（加第一孔细胞时显微镜下观察细胞密度，观察是否符合需求量）4重组质粒与转染剂混合液加至六孔板，记录质粒名称；527湿盒孵育，直到病变现象产生。6.离心，收集上清，保存病毒，细胞沉淀加lysisbuffer做Western-blot检测是否有目的蛋白。,生产重组蛋白,1.将转染过程收集的病毒加入sf9细胞；按以下公式计算所需病毒体积：Inoculumrequired(ml)=MOI(pfu/cell)numberofcells/titerofviralstock(pfu/ml)2.收