多聚体分子免疫学B

分子免疫学专题12主要组织相容性复合物（MHC）、MHC类似分子及其多聚体的应用,授课老师：翁秀芳,主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC): 位于哺乳动物某一染色体上的一组紧密连锁的基因群,其编码产物参与抗原提呈、制约细胞间相互作用及诱导免疫应答，是介导移植排斥反应的主要抗原。* 人类MHC HLA复合体 编码HLA抗原; * 小鼠MHC H-2复合体 编码H-2抗原;,1936年 Peter A.Gorer 用近交系小鼠发现小鼠的移植排斥现象,同种异型移植,同种同型移植,决定移植排斥反应的基因：血细胞抗原2基因H-2系统,斯内尔George D. Snell美国杰克逊实验室1903年-1996年,1948年证明了H-2基因复合体,肾移植后出现的排斥反应,人白细胞表面的某种抗原,人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）,1954年，J.Dausset 发现了人类的MHCHLA系统。,多塞Jean Dausset法国巴黎大学血液免疫实验室1916年2009年,贝纳塞拉夫Baruj Benacerraf美国哈佛大学医学院1920年2011年,1963年，B.Benacerraf发现了免疫应答（Ir）基因，并发现Ir基因与MHC紧密连锁。,斯内尔George D. Snell美国杰克逊实验室1903年-1996年,多塞Jean Dausset法国巴黎大学血液免疫实验室1916年-2009,贝纳塞拉夫Baruj Benacerraf美国哈佛大学医学院1920年-2011,1980年诺贝尔生理学医学奖授予Snell、Dausset和Benacerraf三位科学家，以表彰他们在“调节免疫反应的细胞表面基因决定性结构方面的杰出研究工作。”,MHC 多态性,Class II(HLA-DR),Class I（HLA-A,B,C）,HLA提呈抗原肽的多样性,pMHC作为T细胞特异性的结合配体,多样性机制 a b g d V 70 52 10 7 D 0 2 0 2 J 61 13 2 2组合多样性 4.3x103 1.4x103 20 28 N序列插入 5.5x103 3.0x107 5.5x103 1.6x1011V区基因数 5.8x106 6x102连接多样性 2x1011 1013总 计 1018 1015,T细胞与TCR的多样性,TCR与pMHC特异性结合的可能应用领域？,pMHC作为T细胞特异性的结合配体,检测抗原特异性T细胞,pMHC与TCR结合后作用的双面性,特异性增强,特异性抑制,T细胞的双信号识别,pMHC作为T细胞特异性的结合配体,抗肿瘤抗感染,抗移植排斥抗自身免疫,检测抗原特异性T细胞,可溶性pMHC与TCR的亲和力低,MHC多聚体,抗原特异性T细胞检测与调控的重要工具,pMHC多聚体技术的出现为TCR提供了高亲和力配体,1996年Altman等人建立了pMHC 四聚体技术 Science, 1996, 274(5284):94-96. 被引用次数：23681993年Porto等人建立了pMHC二聚体技术 PNAS,1993, 6671-6675,pMHC四聚体技术,1996年Altman等人建立的MHC-抗原肽四聚体技术， 已成为特异、敏感的检测T细胞克隆的工具。解决了TCR与其配体pMHC单体低亲合力结合的问题，从而实现对带有特定表型TCR的T细胞的特异性染色 。pMHC四聚体的应用已经证实在抗病毒、抗肿瘤研究中具有重要的意义,pMHC单体： 每一个MHC分子与其相应限制性的肽段结合，并具有酶催化的生物化位点 pMHC四聚体： 4个生物素化的可溶性MHC-抗原肽复合物单体与标记的亲合素结合形成的复合物,pMHC I类分子四聚体结构示意图,* pMHC单体： 每一个MHC分子与其相应限制性的肽段结合，并具有酶催化的生物化位点 * pMHC四聚体： 4个生物素化的可溶性MHC-抗原肽复合物单体与标记的亲合素结合形成的复合物,MHC 四聚体结构示意图,HLA 四聚体种类,HLA I类分子：HLA-A2, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A28 ，HLA-B8, HLA-B27等 HLA II类分子：HLA-DR1, HLA-DR4, HLA-DQ 等 非经典MHC分子：HLA-E, HLA-F HLA-G,等MHC类似分子：CD1d， MR1,MHC/抗原肽四聚体制备过程示意图,MHC/抗原肽四聚体,pMHC四聚体与TCR的特异性结合,检测抗原特异性T细胞分选抗原特异性T细胞克隆刺激抗原特异性T细胞调节抗原特异性T细胞,MHC四聚体检测抗原特异性T细胞,四聚体对特异性CTL的检测,Virus,Species,MHC四聚体检测特异性T细胞的频率,通过四聚体测得的病毒感染的急性期与记忆期病毒特异性CD8+T细胞是原先估计值的10倍 惊人的体内抗原特异性T细胞增长速度，在LCMV感染的3-5天，抗原特异性T细胞增倍的时间只需6-8小时。 与原认为的在病毒感染免疫应答中大部分T细胞增殖是非特异性相反，四聚体染色结果说明T细胞的免疫应答主要都是针对病毒抗原，非特异的活化很少 了。,MHC多聚体检测抗原特异性T细胞的基本原理？,pMHC与TCR的特异性结合提供了结构基础pMHC多聚化为检测抗原特异性T细胞提供了足够的亲和力。pMHC多聚体引入的荧光标记实现了抗原特异性T细胞的流式检测,pMHC四聚体分选抗原特异性T细胞,pMHC四聚体刺激抗原特异性T细胞产生,pMHC提供第一活化信号B7与T细胞的CD28结合提供共刺激信号,自身免疫及移植物排斥,Maile等人利用雌性HY-TCR转基因鼠模型对其移植雄性鼠的皮肤，体内注射HY-I类分子四聚体发现可诱导特异性的CD8+T细胞活化，但若成倍增加注射四聚体的剂量，则通过诱导T细胞无能或AICD反应清除雄性特异性的CD8+T细胞，在体内诱导特异性T细胞耐受.,pMHC四聚体在肿瘤免疫治疗的潜力,Ogg与Robert等人报导了一种新的抗瘤策略：应用肿瘤特异性的抗体与pMHC四聚体结合形成复合物，通过特异性抗体靶向结合于肿瘤细胞表面从而使肿瘤细胞对四聚体特异性的CTL的溶解效应敏感。,pMHC 二聚体的构建策略,MHC二聚体,pMHC二聚体对抗原特异性T细胞的检测,利用pMHC二聚体诱导抗原特异性T细胞,利用加载pMHC二聚体的细胞作为抗原提呈细胞该抗原提呈细胞仅提呈单一表位适用于诱导普通抗原特异性T细胞与同种抗原特异性T细胞,在体外制备肿瘤抗原特异性T细胞，探索抗肿瘤的有效方法。在体外诱导病毒抗原特异性T细胞，寻求打破慢性病毒感染的新的途径。获得单一表位特异性T细胞，研究T细胞的识别与效应机制,利用pMHC二聚体诱导抗原特异性T细胞,可溶性pMHC二聚体特异性抑制抗原特异性T细胞,可溶性pMHC二聚体诱导特异性T细胞耐受的示意图,可溶性pMHC二聚体特异性抑制抗原特异性T细胞,可溶性pMHC二聚体在抗移植排斥反应中的应用 OHerrin等人利用小鼠可溶性pMHC I 类分子二聚体体 外诱导同种T细胞耐受 Fried等人应用大鼠pMHC二聚体实现体内保护同种 移植物的作用 可溶性pMHC二聚体在抗自身免疫性疾病中的应用 Masteller等人应用pMHC II类分子作为治疗性的生物分子应用于转 TCR而产生的糖尿病的老鼠。 实验结果显示，可溶性pMHC II类分子二聚体可特异性的抑制自身反 应性T细胞，诱导自身反应性T细胞耐受,MHC多聚体的应用领域？,1. 检测抗原特异性T细胞2. 分选抗原特异性T细胞克隆3. 诱导抗原特异性T细胞4. 调节抗原特异性T细胞,感染免疫肿瘤免疫3. 自身免疫性疾病4. 同种移植排斥反应,MHC 类似分子-MHC Ib分子,CD1 分子MR1分子H2-M3分子HLA-E, HLA-G/Qa-1, Qa-2个体多样性低,CD1分子递呈途径,1. CD1的特征分五型：CD1A、B、C、D、E, 与b2m组成二聚体；与MHCI/II类分子有30%同源性，无多态性；CD1表达于专职APC表面，还可存在于内体/溶酶体腔室中，酸性环境改变其构象，与抗原结合。2. 抗原递呈特征主要递呈糖脂或脂类抗原，特别是分支杆菌的某些成分；递呈给CD4+T、CD8+T、CD4-CD8-T、NK1.1+ T细胞。,脂类抗原的CD1分子提呈途径,CD1d-限制性T细胞NKT细胞,CD1d-restricted iNKT Cells,IL- 4, -10, -13IFN-gIL-17,TNFa,NK1.1,Surface phenotype - TCRint, NK1.1+, CD4+ or CD4-CD8- TCR usage - Va14-Ja18 (Va24-Ja18 in human), preferentially associate with Vb8, Vb7, and Vb2 Can be detected by -galactosyl ceramide(- GalCer) -loaded CD1d tetramers Rapid release of cytokines upon activationImmunological functions - immune responses against pathogens, anti-tumor immunity, autoimmunity,CD1d,Invariant TCR,Type I NKT cell (iNKT cell ),APC,MR1分子提呈途径,Lars Kjer-Nielsen, et al, Nature, 2012, Nov, 491: 717-723,1,2,3,2m,6-FP,6-FP,1,2,2m,3,90o rotation,MR1,HFE,MHC-1,CD1d,MR1限制性T细胞MAIT细胞,* MAIT- Mucosal associated invariant T cells* Surface phenotype: Mainly DN, some CD8 in human TCR usage: Semi-invariant: mV19/mVb6, 8 hV7.2-Ja33/hVb2, 13Predominantly in the Gastrointestinal tract; abundant in human blood and liver. Absence in germ-free miceCan be detected by MR1-6-FP tetramer,Comparison of NKT and MIAT cells,抗原特异性T细胞的检测方法,传统功能实验,依赖于抗原特异性T细胞在体外的增殖活力及细胞毒效力的功能试验,氚标记胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入率测定T细 胞的增殖水平 MTT法测增殖Cr51释放法检测T细胞的特异性杀伤功能 LDH法测杀伤,细胞增殖实验原理,加3H标记的DNA前体(3H胸腺嘧啶苷，3H-TdR),T细胞增殖表现为DNA复制，细胞合成DNA量倍增,3H-TdR掺入新合成的DNA中,根据掺入的多少推测细胞增殖程度,细胞杀伤实验原理,靶细胞被特异性杀伤51Cr释放入培养上清,51Cr掺入培养的靶细胞中，使其摄入胞内,上清中的辐射强度