分子生物学课件1-3讲.ppt

分子生物学,授课教师：张敏跃办公室：分子楼4楼电话：3595108,第一章绪论,第一节分子生物学发展的基础,一、创世说和进化论（一）三个与一切生物学现象有关的问题：生命是怎样起源的？为什么“有其父必有其子”？动、植物个体是怎样从一个受精卵发育而来的？,（二）创世说上帝创造了世间万物，包括人类。（三）达尔文学说1859年达尔文发表了著名的物种起源一书，提出了进化论学说。其进化论思想的精髓可概括为“物竞天择，适者生存”几个字。他认为世界上的一切生物都是可变的，物种的变异是由于大自然的环境和生物群体的生存竞争造成的。,二、细胞学说的建立十七世纪末十八世纪初，荷兰的Leeuwenhoek制作了世界上第一台显微镜，并观察了诸多生物样本。大约与其同时代的Hooke第一个提出“细胞”一词。,十九世纪，德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann建立了细胞学说。他们认为：所有组织的最基本单元是形状非常相似而又高度分化的细胞。细胞的发生和形成是生物界普遍和永久的规律。,三、经典的生物化学和遗传学进化论和细胞学说的结合，产生了现代生物学。而以研究动、植物遗传变异规律为目标的遗传学和以分离纯化、鉴定细胞内含物质为目标的生物化学则是这一学科的两大支柱。,（一）经典的生物化学的成就十九世纪，人们就已经发现了蛋白质。到二十世纪初，组成蛋白质的20种氨基酸被相继发现。Fisher还论证了连接相邻氨基酸的“肽键”的形成。细胞的其他成分，如脂类、糖类和核酸也相继被认识和部分纯化。,1869年，Misescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA。1910年，德国科学家Kossel首先分离得到了腺嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸。,（二）经典遗传学的建立和发展1865年，奥地利科学家孟德尔（GregorMendel）发表了植物杂交试验一书，提出了遗传学的两条基本规律：统一律和分离律。他认为：生物的每一种性状都是由遗传因子控制的，这些因子可以从亲代到子代，代代相传。,1909年，丹麦遗传学家W.Johannsen首先使用“基因”一词。,二十世纪初，美国遗传学家Morgan提出了基因学说。他指出：种质必须由独立的要素组成，我们把这些要素称为遗传因子，或者简单地称为基因。,Morgan及其助手发现了连锁遗传规律，并且第一次将代表某一性状的基因，同某一特定的染色体联系起来。,第二节分子生物学发展简史,分子生物学的定义：是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。,1928年英国科学家Griffith等人发现肺炎链球菌可以引起肺炎，导致小鼠死亡。1944年美国微生物学家Avery通过肺炎链球菌对小鼠的感染实验，证明DNA是遗传信息的载体。,1953年Watson和Crick提出DNA右手双螺旋模型，于1962年和Wilkins共享诺贝尔生理医学奖。同年，Sanger首次阐明了胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河，他于1958年获诺贝尔化学奖。,1954年Crick提出遗传信息传递的中心法则。1958年，Meselson和Stahl提出了DNA的半保留复制。,1961年，法国科学家Jacob和Monod提出了调节基因表达的操纵元（operon）模型，1965年获得诺贝尔生理医学奖。他们还首次提出了信使核糖酸（mRNA）的存在及作用。同年，Nirenberg等人应用合成的mRNA分子poly(U)破译出第一批遗传密码。,1966年，美国科学家Nirenberg等人破译了全部的DNA遗传密码，1969年与Holley和Khorana分享了诺贝尔生理医学奖。1967年发现了可将DNA连接起来的DNA连接酶。,1970年Smith、Qilcox及Kelley分离到第一种可以在DNA特定位点将DNA分子切开的限制性核酸内切酶。同年，美国的Temin和Baltimore发现RNA肿瘤病毒中存在逆转录酶，他们于1975年共享诺贝尔生理学奖。,1972年，Berg、Boyer等人第一次成功地完成了DNA重组实验。1974年，首次实现了异源真核生物的基因在大肠杆菌中的表达。,19751977年，美国人Sanger和Gilbert发明了快速DNA序列测定技术，并于1977年完成了噬菌体X174基因组（5386bp）的序列测定。1980年Sanger和Gilbert与Berg分享了诺贝尔化学奖。,1982年Prusiner提出“感染性蛋白质颗粒”的存在；次年将这种蛋白颗粒命名为阮病毒蛋白（prionprotein,PrP）。1997年，Prusiner因为发现朊病毒而获得诺贝尔生理医学奖。,1984年，德国人Kohler、美国人Milstein和丹麦科学家Jern由于发展了单克隆抗体技术而分享了诺贝尔生理医学奖。,1986年，Mullis发明了PCR技术。1993年Mullis与第一个设计定点突变的Smith共享了诺贝尔化学奖。,1988年Waston出任“人类基因组计划”首席科学家，举世瞩目的人类基因组测序工作开始启动。,1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在不连续基因方面的工作而获得诺贝尔生理医学奖。,1996年，酵母基因组DNA的全部序列测定工作完成。2000年6月26日，人类基因组工作框架图绘制完成,第三节人类基因组计划（HumanGenomeProject，HGP）,一、问题的提出70年代对人类基因组的研究已具有一定的雏形；1986年著名遗传学家MckusickV提出从整个基因组的层次研究遗传学的科学称“基因组学”；,同年，诺贝尔奖获得者DulbeccoR在Science杂志上发表了题为“癌症研究的转折点人类基因组的全序列分析”，得到了世界范围的响应；1986年美国能源部宣布实施这一草案；,1987年美国能源部（DOE）和国家健康研究院（NIH）为HGP下拔了经费1.66亿美元，开始筹建HGP实验室；,1988美国成立了“国家人类基因组研究中心”由诺贝尔奖获得者WatsonJ出任第一任主任。,二、世界的行动1987年，意大利的国家研究委员会（NRC）组织了15个（后来发展到30个）实验室，开始HGP的研究；1989年2月，英国的HGP开始启动;,1990年6月，法国的国家HGP开始启动；同月，欧共体通过了“欧洲HGP研究计划”，主要资助23个实验室；1990年10月1日美国国会正式批准美国的“HGP”启动，计划在15年内投入至少30亿美元进行人类全基因组的分析；,1994年初，在吴旻、强伯勤、陈竺院士和杨焕明教授的倡导下，中国的HGP开始启动；1998国家科技部在上海成立了中国南方基因中心，由陈竺院士挂帅；1998年1999年成立了中国科学院北京人类基因组中心和北方人类基因组中心，由中科院遗传所的杨焕明教授，强伯勤院士等人牵头；,1995年6月，德国正式开始HGP。,三、任务与进展（一）遗传图谱（geneticmap)：，定义又称连锁图谱（linkagemap)或遗传连锁图谱（geneticlinkagemap)，是指人类基因组内基因以及专一的多态性DNA标记(marker)相对位置的图谱，其研究经历了从经典的遗传图谱到现代遗传图谱的过程。,，经典的遗传图谱（以基因表型为标记），现代遗传图谱（以DNA为标记）第一代多态性标记：限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)，位点数目可达105以上。,第二代多态性标记：小卫星/可变数量串联重复（minisatellite/variablenumbertandemrepeat,VNTR)及微卫星/简短串联重复（microsatellite/simpletandemrepeat,STR)。个数在6000个以上。其中STR具高度多态性，有的可形成几十种等位片段，是目前在基因定位的研究中应用最多的标记系统。,第三代多态性标记：单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)。这种标记在人类基因组中多达300万个。,，构建遗传图谱的基本原理：真核生物在减数分裂过程中染色体进行重组和交换，染色体上任意两点之间发生重组和交换的概率随着两点之间相对距离的远近而发生变化。,，构建遗传图谱的意义：通过连锁分析，可以找到某一致病基因或表型的基因与某一标记邻近（即紧密连锁）的证据，从而可把这一基因定位于染色体的特定区域，再对基因进行分离和研究。,（二）物理图谱（physicalmap):：，定义用物理学方法构建的由不同的DNA结构按其在染色体上的原始顺序和实际距离排列的图谱。,，内容基因组的细胞遗传学图（cytogeneticmap，即染色体的区、带、亚带）；序列标签位点(sequence-taggedsite,STS)图谱；,DNA“重叠群(contig)”图谱：把基因组文库中含有相同STS序列的DNA克隆按照其在原始基因组上线形顺序进行排列，连接成相互重叠的“片段重叠群(contig)”。是构建物理图谱的主要任务；,大片段限制性内切酶切点图；cDNA/EST图谱；基因组中广泛存在的特征性序列（如CpG序列、Alu序列等）的标记图等。,（三）序列图谱：2003年之前完成。（四）基因图谱：目标：在人类基因组中鉴别出全部基因的位置、结构和功能；,定位方法：cDNA/EST的染色体定位（实验手段，电子杂交）；完成时间：200？年完成。,（五）模式生物基因组：酵母1996年大肠肝菌1997年线虫1999年果蝇2000年拟南芥菜2000年小鼠2005年之前完成,第四节分子生物学的研究内容,一、DNA重组技术（基因工程）（一）DNA重组技术的含义：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并将之导入到原先没有这类分子的寄主细胞内，从而使接受者产生新的遗传性状的技术。,关键技术：限制性内切酶、DNA连接酶及其他工具酶的发现和应用。,（二）DNA重组技术的建立,（三）DNA重组技术的应用,可用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽；可用于定向改造某些生物基因组结构可用于基础研究,二、基因表达调控研究生物个体在生长发育过程中，基因表达是按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）的。基因表达调控研究的主要方面有：,（一）信号转导（singnaltransduction)研究信号转导：指外部信号通过细胞膜上的受体传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其他细胞功能方面的应答过程。,（二）转录因子研究转录因子：是指一群能与基因5端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。（三）RNA剪接研究,三、生物大分子结构功能研究（又称结构分子生物学）（一）概念：是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。,（二）结构分子生物学的研究方向：结构测定；结构运动变化规律；结构与功能关系的建立。,（三）结构分子生物学的研究手段物理和化学手段：射线衍射的晶体学（蛋白质晶体学）；二维和多维核磁共振；电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法；化学合成；分子生物学手段,第五节分子生物学的展望,对神经生物学的影响对遗传学的影响对分类和进化研究的影响对发育生物学的影响对现代医学的影响其他,一、分子生物学对生命科学各个领域的渗透,统一生物学（generalbiology)：生物学范畴内所有学科在分子水平上的统一。,二、人类基因组计划的延伸人类后基因组（功能基因组）研究,（一）蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics),，蛋白质组：由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。，蛋白质组的动态性,（1）原因：同一个机体的不同组织和不同细胞；在同一机体的不同发育阶段；机体的生理状况；机体所处的外界环境。（2）结果：基因mRNA表达种类的改变；基因表达的不同形式（基因剪接，蛋白质翻译修饰，蛋白质剪接等）。,测定一个有机体的基因组所表达的全部蛋白质。,3，蛋白质组学的任务：,（二）后基因组研究的研究内容：,人类基因组多样性计划（HumanGenomeDiversityProject）环境基因组学（EnviromentalGenomics）肿瘤基因组解剖计划（CancerGenomeAnatomyProject）药物基因组学（Pharmacogenomics）,核心问题：基因组的多样性；遗传疾病产生的起因；基因的表达调控作用；蛋白质产物的功能。,第二章遗传的物质基础,第一节遗传物质的本质,一、DNA是遗传物质（一）、DNA是遗传物质的证明,1928年Griffith等进行的肺炎球菌转化（transformation）实验1944年Avery证明DNA是遗传物质,（二）DNA携带两类不同的遗传信息1，负责基因结构的信息2，负责基因选择性表达的信息,二、RNA也可作为遗传物质（一）RNA病毒病毒颗粒（viron）：由病毒RNA基因组和包被在外的蛋白质外壳组成病毒的生存方式：病毒编码包装基因组所需的蛋白，以及一些在感染循环中复制病毒所需的蛋白质。其他蛋白质由宿主提供。因此病毒不能独立生存。,（二）类病毒（viroid）类病毒:是使高等植物产生疾病的有传染性的因子，由很小的环状RNA分子构成。与病毒不同，类病毒的RNA本身就是感染因子。类病毒只由RNA组成，其中广泛存在不完全的碱基配对，形成一种特有的棒状结构。类病毒的基因组不能编码蛋白质。,类病毒的复制：必须由宿主的酶来完成，其RNA作为模板。类病毒对宿主的影响：类病毒可通过复制占有宿主细胞中关键的酶，从而影响宿主细胞的正常功能；类病毒也能影响必需的RNA的产生而引发疾病；它们还可以作为一个不正常的调控分子，对个别基因的表达产生特殊的影响。,三、是否存在核酸之外的遗传物质？（一）朊病毒（prion）：是一个28KDa的疏水性糖蛋白，由细胞的核基因编码，在正常动物的脑组织中有表达。（二）朊病毒的存在形式：朊病毒以感染性形式（PrPSC)，和非感染性形式（PrPC）两种形式存。,（三）两种形式的朊病毒的异同：PrPCPrPSC功能：不详导致退行性神经疾病分布：正常脑被感染脑抗蛋白酶性：可被完全降解只能被部分降解溶解性：可溶难溶一级结构：两者相同二级结构：40%螺旋20%螺旋，50%折叠,（四）朊病毒的感染方式PrPSC作用需要PrPC的参与PrPSC蛋白的错误折叠形式可以催化天然PrPC分子从正常的可溶性的螺旋构象向不溶性的折叠构象转化，最终导致了疾病和感染。,（五）朊病毒的多株现象不同PrPSC株可使一种PrP结构转化为不同的构型；而同一种PrPSC可以在具有不同PrP蛋白的多种生物中传代，即使经过多次传代仍然保持自身的生物学特征。（六）朊病毒是遗传物质吗？多株现象难以解释其感染方式能否被视为遗传复制？,第二节DNA的一级结构,一、DNA一级结构的组成一级结构：4种核苷酸的连接及其排列顺序(一）含氮碱基（nitrogenousbases）,DNA中的常见碱基有：胞嘧啶（cytosine,C）、胸腺嘧啶（thymine,T）、腺嘌呤（adenine,A）和鸟嘌呤（guanine,G）,（二）脱氧核糖核苷（nucleoside）由碱基和戊糖（D-脱氧核糖）缩合而成。有4种脱氧核糖核苷：胞嘧啶脱氧核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷）和鸟嘌呤脱氧核糖核苷,+,+,H2O,（三）脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide）脱氧核糖核苷和磷酸缩合形成的磷酸酯,所有的核苷酸的5位置可以连接一个以上的磷酸基团。从戊糖开始的第一、二、三个磷酸残基依次称为、核苷三磷酸缩写为NTP，核苷二磷酸缩写为NDP。,（四）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）脱氧核糖核苷酸以3，5磷酸二酯键聚合成为脱氧核糖核酸（DNA）链。链的一端的核苷酸有自由的5磷酸基团，称5端；另一端核苷酸具有自由的3羟基，称3端,DNA链的方向就是从5端到3端。DNA分子通常以线性或环状的形式存在。大多数DNA由两条互补的单链构成。少数生物的DNA，如某些噬菌体或病毒是以单链形式存在的。,二、DNA的碱稳定性DNA对碱相对稳定RNA在碱性溶液中易降解为2，3环式单核苷酸中间产物，然后很快转变为2单核苷酸和3单核苷酸。,三、序列测定方法（一）小片段重叠法（二）凝胶直读法1，酶法（1）加减法（Sanger,1975）（2）末端终止法(双脱氧法/间接拷贝法)（Sanger,1977）,末端终止法的应用循环测序（cyclesequecing)实验及原理a.测序反应的设定体系中包括：DNA模板，TaqDNA聚合酶，寡核苷酸引物，4种dNTP和荧光ddNTP（4种荧光）等；b.反应包括：DNA变性，引物与模板配对，DNA聚合酶使引物延伸（在引物3末端接上dNTP或ddNTP）；c.反应的终止20-30个循环后，新合成所有可能的DNA片段，每个片段的3末端都被接上ddNTP，延伸终止；d.反应产物电泳分离及检测在聚丙烯凝胶中，不同大小的DNA片段在高压电场作用下迁移，小分子迁移速度快，先被位于凝胶底部的装置检测到。e.结果的处理及输出根据被检测到的DNA片段的顺序及颜色，绘出DNA片段的电泳图谱。DNA序列中的每个核苷酸由一系列按顺序排列的彩色峰型显示出来,2，化学法（Maxam/Gilbert,1977）适用于DNA短片段的测定四、一级结构的重要性携带遗传信息决定DNA的二级结构决定DNA的空间结构,第二节DNA的二级结构,一、DNA螺旋的几种构象及其动态平衡（一）WatsonCrick右手双螺旋结构（B-DNA构象）相对湿度为92%时，DNA钠盐纤维为B-DNA构象。在天然情况下，绝大多数DNA以B构象存在。1，主链:2，碱基对3，螺距4，大沟和小沟,（二）A-DNA构象为相对湿度改变（75%以下）或由钠盐变为钾盐、铯盐，DNA的结构可成为A构象。它是B-DNA螺旋拧得更紧的状态。DNA-RNA杂交分子、RNA-RAN双连分子均采取A构象。,（三）Z-DNA构象在一定的条件下（如高盐浓度），DNA可能出现Z构象。Z-DNA是左手双螺旋，磷酸核糖骨架呈Z字性走向。不存在大沟，小沟窄而深，并具有更多的负电荷密度。,B-DNA、A-DNA及Z-DNA结构特征比较B-DNAA-DNAZ-DNA每圈bp数10-10.61112每bp转角（度）+34.6+34.7-30每bp上升距离（A）3.382.565.71螺旋直径（A）192318,B-DNA是活性最高的DNA构象，B-DNA变成A-DNA后，仍有活性，但若局部变构为Z-DNA后，活性明显降低。,二、决定双螺旋结构状态的因素（一）氢键1，碱基的氢供体氨基、羟基2，碱基的氢受体酮基、亚氨基3，GC对及AT对之间的氢键在一定范围内DNA的稳定性与GC百分含量成正比（图1-2）,4，氢键数对DNA双链稳定性的影响5，碱基之间形成氢键的条件互补性方向性,（二）碱基堆集力1，碱基堆集力同一条链中的相邻碱基之间的非特异性作用力2，碱基堆集力的来源疏水作用累积的VanderWaal的作用力3，碱基堆集作用的证据单链多核苷酸倾向于碱基平行排列的规则螺线结构破坏疏水作用和双链的氢键可降低DNA的稳定性,（三）带电荷的磷酸基的静电斥力磷酸集团的负电对DNA双链的稳定性起负作用。阳离子可对之产生屏蔽。DNA溶液的离子浓度越低，DNA越不稳定。（四）碱基分子内能碱基内能越高，氢键和碱基堆积力越容易被破坏，DNA双链越不稳定,第三节DNA的高级结构,一、正超螺旋和负超螺旋（一）形成超螺旋的原因和条件原因：因某种原因引入了额外的螺旋条件：a,DNA双螺旋闭合或被蛋白结合，末端不能自由转动；b,DNA双链上无断裂（二）正超螺旋（二）负超螺旋,二、描述DNA螺旋状态的带子模型(一）L=T+W1，L：连接数（linkingnumber）；specifiesthenumberoftimesthatthetwostrandsofthedoublehelixofaclosedmoleculecrosseachotherintoto.2，T：初级螺旋数（twistingnumber）；representstherotationofonestrandabouttheother.3，W：超螺旋数（writhingnumber）；representstheturningoftheasisoftheduplexinspace.,有相同的一级结构，而L值不同的DNA分子叫做拓扑异构体。在DNA双链不发生断裂的前提下，L值不变。（二）L=W+T（三）比连接差（specificlinkingdifference)；1，表达式：=（L-L0）/L0（L0：表示松弛环型DNA）2，含义：用来表示超螺旋的程度；当初级螺旋数不变时，代表超螺旋密度。,三、影响DNA高级结构的酶L值的改变需要至少一条DNA链断裂一次。断裂造成的DNA自由末段的一断可绕着另一端旋转，随后被重新连接，DNA拓扑异构酶通过催化此类反应将DNA从一种拓扑结构转变成另一种。,（一）I型DNA拓扑异构酶（图1-25）底物：DNA单链ATP：不需酶活性：DNA内切酶和连接酶活性代表：E.Coli的DNA拓扑异构酶I：可催化负超螺旋DNA转化为松弛环型鼠DNA拓扑异构酶I：对正、负超螺旋有相同的松弛能力,原理：E.coli拓扑异构酶识别部分解螺旋的DNA分子，与DNA单链部分结合后，切断一条链，并以其酪氨酸残基与DNA的5磷酸相连。磷酸二酯键从DNA转移蛋白质上。酶将完整的DNA链拉过缺口后（L=+1），重新连接原先单链上磷酸二酯键。,上述过程除了改变DNA的超螺旋结构外，还可使单链环状分子形成三叶结构，以及使两个单链环状分子成为环连体分子。（图1-24）,（二）II型DNA拓扑异构酶底物DNA双链ATP需要酶活性DNA内切酶和连接酶活性代表E.Coli旋转酶（DNAgyrase,DNA拓扑异构酶II），可引入负超螺旋。无ATP时，此酶只能缓慢地松弛负超螺旋。,E.Coli的旋转酶还具有形成和拆开双链DNA环连体和成结分子的能力。此类酶无碱基序列特异性。,（三）DNA拓扑异构酶催化反应的实质：其本质是先切断DNA的磷酸二酯键，改变DNA的链环数后再连接，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能。然而这些酶并不能连接事先已经存在的断裂DNA，即其断裂及连接反应是相互偶联的。,第四节DNA的变性、复性、杂交和Cot曲线,一、DNA的变性DNA变性（熔解）：DNA被加热或某些试剂的作用下，配对碱基之间氢键和相邻碱基之间的堆集力受到破坏，逐步变为近似于无规则的线团构型即变性DNA的过程。,（一）单、双链DNA的紫外光吸收双链DNA：A260=1.0时，50g/ml单链DNA：A260=1.0时，33g/ml（单链RNA：A260=1.0时，40g/ml）,（二）DNA的熔解曲线1，Tm值：缓慢而均匀地DNA溶液的温度，当A260增加到最大增值的一半时的温度，叫做DNA的熔解温度或熔点，用Tm表示。2，计算Tm值的经验公式在0.15mol/LNaCl+0.015mol/L柠檬酸钠溶液中，当DNA长链G+C百分含量在30%70%时Tm=69.3+0.41（G+C）%当DNA链长度为1470nt时Tm=81.5+16.6lgNa+0.41（G+C）%-0.6甲酰胺%-600/L-1.5错配%当DNA链长度18nt时，可近似认为Tm=4（G+C）+2（A+T）,二、复性DNA复性：变性DNA在一定条件下恢复天然DNA的结构的过程。（一）复性的条件1，消除磷酸基的静电斥力；2，破坏连内氢键（二）复性的机制1，随机碰撞取决于DNA浓度、溶液温度、离子强度等2，成核作用（nucleation)3，拉拉链作用（zippering）,三、杂交重要的杂交技术：SouthernBlottingNorthernBlotting,3.InSituHybridization,4.ColonyHybridization,四、Cot曲线（一）DNA复性的动力学1，单链消失的速度：-dc/dt=kc2C/Co=1/(1+kCot)k：为二级反应常数（单位：L/mol秒），受DNA分子序列的复杂性、阳离子浓度、温度的影响C:单链DNA的浓度（核苷酸摩尔数/L）,当C=1/2C0(即DNA复性一半）时Cot（Cot）=1/kDNA分子序列的复杂性X：最长的没重复序列的核苷酸对的数值。CotX：在DNA总浓度相同的情况下，X值越小，片段浓度越高，复性时间越短，Cot越小。X=KCot（影响K值的因素：阳离子浓度、温度、片段大小）,2，Cot曲线,不同物种核酸的Cot曲线,3，原核生物DNA的复性动力学（图1-10）原核生物Cot曲线形状：不同生物曲线形状相似，都是单一序列；原核生物Cot曲线跨度：一般只有两个数量级；原核生物Cot曲线位置：基因组越大越靠右。,4，真核生物DNA复性动力学（1）真核生物的DNA复性曲线（图2-8）真核生物Cot曲线特点：阶梯状，跨度7-8个数量级。真核生物Cot曲线的组成：快复性组分/中间复性组分/慢复性组分,（2）3种复性组分复杂性的计算X=KC0t1/2每种复性成分的实际C0t值=测得的C0t值该组分占总DNA的百分比待测样品DNA的复杂长度=标准DNA的复杂长度待测样品DNACot/标准DNACot,化学复杂长度和动力学复杂长度化学复杂长度：通过化学方法测量得到的DNA长度动力学复杂长度：按照复性动力学计算出来的DNA复杂长度基因组的化学复杂长度单一序列的动力学复杂长度/单一序列的百分比,（3）每一组分拷贝数（重复频率）的计算重复频率f=化学复杂长度/动力学复杂长度=（基因组化学复杂度标准DNAC0t）/（待测DNA样品C0t标准DNA样品动力学复杂长度）,（4）同一复性曲线各组分的Cot与重复频率的关系C0t（1）：C0t（2）=f（2）：f（1）f（2）=f（1）C0t（1）/C0t（2）,第三章基因与基因组,一、基因概念的历史演变1909年W.Johannsen首先使用“基因”一词，其含义与孟德尔的“遗传因子”完全一致。此阶段基因只是逻辑推理的产物。,第一节基因,20世纪初，T,H.Morgan等人提出连锁交换规律和伴性遗传，指出基因在染色体上直线排列。1926年Morgan在基因论中指出基因代表着一个有机的化学实体。,1941年Beade和Tatum提出了“一个基因一个酶（onegene:oneenzymehypothesis）”的假说，认为：基因是一个DNA片段，负责编码一个蛋白酶（蛋白质）。当一种蛋白质是由异源亚基构成时，该假说应修正为“一个基因一条多肽链”。,1955年，S.Benzer提出了顺反子（cistron），突变子（muton）和重组子（recon）等术语。顺反子学说认为，顺反子是一段编码一种多肽链的核苷酸序列，是一个功能单位。该学说否定了基因是决定遗传形状的功能单位，同时也是突变和重组的最小单位的看法。而突变子和重组子最终被证明是以单核苷酸对为单位的。,目前对基因的认识是：基因是能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）的核苷酸序列。其内容可扩展至包括两侧对基因表达的起始和终止所必需的调控序列。,Gene(cistron)isthesegmentofDNAinvolvedinproducingapolypeptidechain;itincludesregionsprecedingandfollowingthecodingregion(leaderandtrailer)aswellasinterveningsequences(introns)betweenindividualcodingsegments(exons).,二、基因的现代概念1，转座成分（transposableelements）又叫做移动基因（movablegenes）是一些可以在染色体基因组上从一个位置转移到另一个位置，甚至在不同染色体之间跃迁的DNA成分。有人将之形象地称为跳跃基因（jumpinggenes）。,跳跃基因是由美国女科学家B.McClintock于上个世纪的40年代后期在玉米中首先发现的。当时称为激活-解离因子（activator-dissociationelement，即Ac/Ds因子）。（P449）,2，断裂基因（splitinggene）真核基因的核苷酸序列中间有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。这种编码序列不连续的间断基因称为断裂基因。现已证实，除了真核生物外，少数原核生物，如大肠杆菌T4噬菌体中也存在断裂基因。,3，假基因（pseudogene）是一些核苷酸序列与其相应的正常功能基因基本相同、但却不能合成出功能蛋白质的失活基因，通常积累了较多的突变。现已在大多数真核生物中发现了假基因的存在。假基因数量一般较少。,4，重叠基因不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的，即这些基因的核苷酸序列是彼此重叠的，这样的基因称为重叠基因（overlappinggenes）或嵌套基因（nestedgenes）。目前已在病毒、噬菌体和少数真核基因中发现了重叠基因。,三、基因的分类基因按其产物的功能可分为结构基因、调控基因和RNA基因：1，结构基因：可被转录形成mRNA，并进而翻译成多肽，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等；,2，调控基因：指某些可调节控制结构基因表达的基因。3，RNA基因：是一些只转录不翻译的基因，包括核糖体RNA基因，专门转录rRNA；以及tRNA基因，专门转录tRNA。,第二节原核生物的基因组,一、大肠杆菌（E.coli）的染色体及其基因（一）E.coli的染色体类核：大肠杆菌中可有2-4个DNA相对集中的区域，即类核,染色体结构：E.coli的染色体DNA是一个由4.2X106碱基对组成的双链环状分子。多种DNA结合蛋白和RNA可使染色体压缩成一个脚手架（scaffold)结构,分成大约100个小区（domain）（图2-2）。,（二）E.coli的基因组的特点1，功能相关的结构基因通常构成操纵元操纵元（operon）：大肠杆菌功能上相关的几个结构基因前后相连，由一个共同的调节基因和一组共同的控制位点，即启动子（promoter）和操作子（operator）对其表达过程实行协同调节控制。细菌基因表达调控的这样一个完整的单元，称为操纵元,调控元（regulon）：几个操纵元和它们共同的调节基因所构成的基因表达调控单元2，蛋白质基因通常以单拷贝形式存在3，RNA基因通常是多拷贝的大多数大肠杆菌菌株都有7个核糖体基因（rrn）操纵元，多数rrn操纵元分布在DNA复制起始位点附近4，其他基因的调控形式多样,二、噬菌体174的基因组及其基因（一）174噬菌体概况20面体，无尾。其DNA为单链环状，含5386个碱基。,（二）174基因组的特点1，有11个基因，分别从基因A、B、D开始转录成3个mRNA2，非编码区DNA占基因组的4%,3，有重叠基因和基因内基因基因内基因：B在A*内，E在D内；部分重叠的基因：K和C只有一个碱基对重叠的基因：D的终止密码的最后一个碱基是J起始的第一个碱基，两者ORF不同,三、噬菌体的基因组及其基因（一）噬菌体的概况1，一般情况染色体DNA为双链，共有48502个碱基对。在不同的生长状态下，噬菌体DNA可以以环状分子（带切刻），和线形分子（具有两个粘性末端）两种形式存在（图2-6）,2，噬菌体的生活史（1）溶菌（裂解）周期（lyticcycle）基本过程：吸附：噬菌体吸附到细菌表面的特殊接受器上注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞转变：被感染细菌功能发生变化，成为制造噬菌体的场所,合成：寄主细胞大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质组装：噬菌体DNA包装头部和尾部蛋白，成为噬菌体颗粒释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来,噬菌体溶菌（裂解）周期（lyticcycle）基本过程,（2）溶原周期（lysogeniccycle）溶原化（lysogenization）：噬菌体以环状分子存在于寄主的细胞质中，或整合到寄主的染色体上，并与寄主染色体一起复制，这种状态称为溶原化,溶原性细菌（lysogen）：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌原噬菌体(prophage）：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA超感染免疫性（immnitry）：溶原性细菌可以抗御同种噬菌体再感染的特性,溶原菌的诱发（induction）：溶原菌因某种原因进入溶菌周期的现象。在诱发过程中，噬菌体基因组以单一DNA片段的形式从寄主染色体DNA上删除下来，然后环化成环形DNA分子,噬菌体的生活史,（二）噬菌体的基因组1，基因簇噬菌体的基因除N和Q两个基因外，其余是按功能的相似性聚集成簇的。例如头部、尾部、复制及重组四大功能的基因各自聚集成4个基因簇,2，噬菌体的基因组分区（1）左侧区：自基因A到J，包括参与噬菌体头部及尾部蛋白质合成的全部基因,（2）中间区：介于基因J和N之间，占全基因组30%。部分基因与细菌整合到寄主DNA上和溶源生长有关。这部分的基因不是噬菌体裂解生长所必需的，用其他外源DNA片段代替该区域对噬菌体的感染和生长都不会有严重影响。,（3）右侧区：位于N基因的右侧，包括主要的调控成分、噬菌体的复制基因（O和P）以及溶菌基因（S和R）,第三节真核生物的基因组,一、基因组大小和C值矛盾（一）C值1，概念：一个物种的单倍体基因组