植物叶绿体DNA的提取

实验1植物叶绿体DNA提取、PCR扩增和电泳观察实验目的1、学习从新鲜绿叶中提取叶绿体DNA2、琼脂糖凝胶电泳观察掌握DNA的工作方法3、学习和掌握PCR实验的原理和操作方法实验原理叶绿体是绿色植物光合作用的小器官，具有相对独立的遗传物质叶绿体基因组DNA(ctDNA)，大小在120 160kb之间，其DNA分子以共价、闭合、环状的双链形式存在。CpDNA是比较保守和重要的功能，因此广泛用于细胞质遗传、植物系统发育、遗传多样性、血缘关系等多方面研究，纯度高、产量高、结构完整的ctDNA是进行相关研究的前提。但是ctDNA提取是限制深入研究的重要因素，传统的提取方法包括从梯度离心提取ctDNA的方法，对设备的要求高，成本高，时间长，产量低。因此，尽可能快速、轻松地获得高质量的ctDNA。应该得到。一般来说，很难获得纯度高、浓度大的叶绿体DNA。因为叶绿体DNA的含量太少，同时提取时多种因素(例如核DNA、RNA、蛋白质等)受到干扰。本实验改进了一些传统操作，提取叶绿体基因组DNA的同时，用琼脂糖凝胶电泳及PCR实验试验了提取效果。实验仪器和试剂1、设备：剪刀、烧杯、吸管、洋桶、匀浆机、纱布、300网眼尼龙、注射器、离心管、滤膜2，试剂：酶溶液：1%纤维素酶，0.6毫米蔗糖，8毫米CaCl22H2O，10毫米NaH2PO42H2O，pH5.6清洁液：0.6毫米蔗糖，8毫米CaCl22H2O，2毫米NaH2PO42H2O，pH5.6 10%SDS溶液a: 25mm EDTA，50mM Tris，pH=8.0三萜饱和酚、氯仿、异丙醇、TE、琼脂糖、金视图、Loading buffer、DNA marker新鲜的叶子 PCR缓冲，Mg2，dNTP，相，下游引物，ddH2O，Taq DNA聚合酶实验阶段第一，刀片式服务器收集收集适量新鲜绿叶(约10g)第二，细胞断裂首先用剪刀将叶子切碎，然后放入匀浆机中，放入没有酶的酶，均匀后，扔掉残渣，将液体转移到烧杯中，将纤维素酶全部浓度混合到1%，然后将50度水浴混合30分钟左右。三、叶绿体分离去除用酶处理的液体，依次过滤纱布、300网状尼龙和大型注射器，提取草料。1，电气组：以上滤液为50mL离心管，3000rpm离心3分钟报废。用10mL清洗液清洗3000rpm离心力3分钟，冲洗两次后分离叶绿体。2、使用电调：使用大型注射器和0.2m滤膜过滤上述滤液后，刮除滤膜中的叶绿体，转移到1.5mL离心管，分离叶绿体。四、DNA提取1、电气组：在叶绿体中注入500L溶液a，将叶绿体转移到1.5mL离心管。 200L10%SDS(叶绿体膜分解，释放DNA，搅拌后静置2分钟； 350L苯酚(蛋白质变性)350L氯仿(与苯酚互溶，消除苯酚容易)，混合，10000rpm离心2分钟；将上层液体转移到新的离心管，加入当量氯仿(酚去除)，搅拌，10000rpm离心2分钟；将上层液体转移到新的离心管，将大小为0.6倍的异丙醇(沉淀DNA)沉淀10分钟。 10000rpm离心5min，报废；添加500L70%乙醇(去除盐离子)洗涤沉淀，10000rpm离心5min，干燥；30L TE DNA；溶解；溶解。2、没有电气组：在叶绿体中添加500L溶液a，使叶绿体悬浮。加入200L10%SDS，搅拌2分钟。饱和适量KI固体后，加入明显分层。将下面的透明液体转移到DNA吸附柱上，用冲洗耳朵的球注入液体，DNA吸附在硅胶膜上，将液体扔掉；在吸附柱中添加500L70%乙醇，用洗脸球吹掉液体，晾干；将吸附柱插入新的1.5毫升离心管，用30L TE溶解DNA，用盥洗槽将液体吹入离心管。五、PCR放大特征条带25L系统：Pcr缓冲区2.5 lMg2 1.5LDNTP 2.0L上下底漆分别将2.5L添加到PCR管中DdH2O 8.0LTaq DNA聚合酶1.0LDNA模板5.0LPCR结束后，取5 L，在O.8%琼脂糖上进行电泳观察。六、叶绿体DNA电泳观察用O.8%的琼脂糖进行电泳后，用电泳后自制的LED灯观察