磁珠法核酸提取裂解液的作用原理

磁珠法核酸提取裂解液的作用原理磁珠法核酸提取裂解液的作用原理 磁珠法核酸提取是以纳米生物磁珠为载体的一种新型核酸提取技术， 核酸分 子可与磁珠表面的硅羟基发生特异性识别与结合， 在外部磁场的作用下发生聚集 或分散，彻底摆脱传统核酸提取过程中离心、抽取上清液等手工操作流程，从而 实现核酸的自动化提取。广泛应用于临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环 境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。 GNT 系列的磁珠法核酸提取试剂盒一般包括裂解、结合、洗涤、洗脱四个主 要步骤，每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现，其中裂解环节是决定 提取之质量的重中之重， 经常也会有老师问到应该如何对裂解液进行优化。 那么， 我们就来分析一下配置裂解液经常用的试剂及其作用原理。 1、盐酸胍盐酸胍、尿素尿素 盐酸胍在浓度为 4-8mol 时可断裂氢键，有两种可能机制：1、变性蛋白和盐 酸胍、尿素优先结合，形成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，引起 N-D 反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物， 最终导致蛋白质完全变性；2、盐酸胍、尿素对氨基酸具有增溶作用，能形成氢 键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，成为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质 内部的疏水残基伸展和溶解性加强， 盐酸胍、尿素引起的蛋白变性往往是不可逆 的。 同时盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，但并不是一种足够强的变性剂，可以 允许完整的 RNA 从富含 RNase 的组织中提取出来。高浓度尿素同样可以使使蛋 白质变性并抑制 Rnase 活性。 2、异硫氰酸胍异硫氰酸胍 蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级 结构的破坏消失而迅速与核酸分离。 在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是 异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一种随机的卷曲状态。含有强力的阴 离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下，异硫氰 酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如 SDS 存在的情况下，可以破坏疏水作用。 3、二硫苏糖醇二硫苏糖醇（DTT） 二硫苏糖醇的主要作用是破坏 RNase 蛋白质中的二硫键， 使 Rna 酶变性， 同 时抑制酚类氧化引起的磷酸二酯键的断裂及导致 RNA 和 DNA 的交联。 二硫苏糖醇刺激性气味不大，毒性较低。由于容易被空气氧化，因此 DTT 的稳定性较差；但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质 子化的硫的亲核性较低，随着 pH 值的降低，DTT 的有效还原性也随之降低；DTT 或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理。 4、蛋白酶蛋白酶 K 一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。 它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧 基端肽键。 此酶经纯化去除了 RNA 酶和 DNA 酶活性。 由于蛋白酶 K 在尿素和 SDS 中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳 的染色体 DNA，蛋白质印迹以及去除 DNA 和 RNA 制备中的核酸酶。蛋白酶 K 的 一般工作浓度是 50100g/ml。在较广的 pH 范围内（pH 4-12.5）均有活性。 以上是裂解液中常用的试剂，在实际操作中针对不同的样本（植物组织、动 物组织、全血、血清、质粒）应配制不同浓度的裂解缓冲液，并根据样本的状态 （质量、体积）及期