骨髓检查及细胞化学染色检验

骨髓检查及细胞化学染色检验,湖南省第二人民医院 邹国英 85232281骨髓检查及细胞化学染色检验,掌握：常用细胞化学染色（过氧化物酶染色、过碘酸-雪夫染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色、中性非特异性酯酶染色、碱性-丁酸萘酚酯酶染色、酸性磷酸酶染色、酯酶双染色、骨髓铁染色）的原理、方法、结果分析和临床意义。,骨髓检查及细胞化学染色检验,熟悉：正常血细胞对化学染色的反应。,骨髓检查及细胞化学染色检验,了解：流式细胞仪的构造、原理、主要技术指标和临床应用。 染色体分析在临床血液学中的应用。 分子生物学检查在血液学中的应用。常用FISH技术的种类、原理、方法和临床应用。常用造血干/祖细胞培养的种类、原理和临床应用。非显带染色体和显带染色体相关概念和技术。常见染色体数目和结构异常的有关概念和表示方法。核酸分子杂交技术原理和方法。聚合酶链反应原理和常用PCR产物检查方法。以PCR为基础的相关技术。基因芯片技术。细胞凋亡概念，细胞凋亡形态学的基本变化及主要生物化学特征。细胞凋亡的机制。,细胞化学染色检验,细胞化学染色，是一种以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质作定位、定性及半定量分析的方法。,细胞化学染色检验,血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构，反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性。血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。,细胞化学染色检验,基本步骤固定：蒸汽、液体固定有色沉淀反应：偶氮偶联法、普鲁士蓝反应、雪夫反应、联苯胺法复染,细胞化学染色检验,临床意义辅助判断急性白血病的细胞类型辅助血液系统疾病的诊断和鉴别诊断观察疾病疗效和判断预后 探讨某些疾病的发病机制,一、过氧化物酶染色（POX）,原理：粒细胞和单核细胞胞浆中含有的髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）能将底物过氧化氢分解，产生新生态氧，它将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化，显棕色四甲基苯醌二胺，再加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合，可形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞浆内酶所在的部位。,POX结果判断,细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。（） 无颗粒沉着；（a）（） 颗粒细小 ，分布稀疏；（b）（+） 颗粒较粗，局灶分布；（c） （+） 颗粒粗大，分布较密，占胞质 1/22/3 ；（d）（+） 颗粒粗大，呈团块分布；（e）（+） 全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核（f） 。,各种细胞过氧化物酶染色,嗜碱粒细胞,嗜酸性粒细胞,原幼粒细胞,骨髓片POX染色,临床意义,POX染色是辅助诊断急性白血病细胞类型的首选、最重要的细胞化学染色。（1）粒系：POX主要分布在粒细胞和单核细胞内，随着粒细胞成熟的程度而逐渐增强，中性分叶核粒细胞为强阳性。 嗜酸性粒细胞阳性程度最强，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。 嗜碱性粒细胞为阴性。,（2）单核细胞： 原始单核细胞为阴性反应， 幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应，颗粒细小，弥散分布。,临床意义,（3）其他细胞淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细 胞、巨核细胞均呈阴性反应。（4）血小板过氧化物酶主要定位于幼稚型巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种标志物，有助于FAB M7的识别。,临床意义,骨髓片POX染色,APL：呈强阳性反应,AML-M4：部分呈阳性反应， 部分成弱阳性反应,AML-M5：呈弱阳性,ALL：呈阴性，10个铁颗粒。 正常范围：12% 44% ，平均21.4%， 多见型，少见型，无、型。,细胞内铁,结果判断,（3）环形铁粒幼红细胞： 指含铁颗粒6个，其中1/2以上铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整环形。 正常或非铁粒幼细贫血无环形铁粒幼细胞，铁粒幼细贫血中环形铁粒幼细胞6%,环形铁粒幼细胞,临床意义1缺铁性贫血时，骨髓细胞外铁明显减少，为“一”“士”，细胞内铁平均5.9%，仅为I型。经有效铁剂治疗后，外铁增多。因此骨髓铁染色是诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法。2铁粒幼细胞性贫血时，外铁“2”一“3”，内铁平均70%，其铁粒粗大，以 型为主，出现较多环形铁粒幼细胞。因此，本实验是诊断铁粒幼细胞贫血的有效方法。MDS也可出现环形铁粒幼细胞。 3. 非缺铁性贫血如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度的增加。但再生障碍性贫血不会出现环形铁粒幼细胞，可作为与MDS鉴别的参考。 4. 继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少，但细胞外铁不减少。,五、过碘酸-雪夫染色（PAS）,原理：过碘酸-雪夫（Periodic acid-schiff，PAS）染色又称糖原染色。胞浆内存在的糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖酯等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（Periodic acid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫（Schiff）试剂中的无色品红结合，形成紫红色化合物而沉积于胞浆中糖原类物质所存在的部位。该反应称为过碘酸-雪夫（PAS）阳性反应。,PAS结果判断,细胞质内有出现红色颗粒、块状或呈弥漫状红色者为阳性。（）胞质无色，无颗粒。（+）胞质淡红色或有少量红色颗粒，通常10个颗粒。（+）胞质红色或有10个以上红色颗粒。（+）胞质呈暗红色或有粗大红色颗粒，可出现红色块状。（+）胞质呈紫红色或有粗大红色块状。,临床意义（1）M6与巨幼贫的鉴别 M6的幼红细胞PAS可呈强阳性，积分明显增高，巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴性。（2）急性白血病的类型鉴别 ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性，AML为阴性，急性单核细胞白血病时原单核细胞及幼单核细胞PAS阳性，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。,PAS染色,AML-M6幼红细胞呈阳性反应,MA幼红细胞呈阴性反应,ALL-L1,L1 PAS(+),AML-M5,M5 PAS(+),AML-M6,AML-M6 PAS(+),AML-M7,M7 PAS(+),（3）巨核细胞和Sternberg细胞鉴别 巨核细胞PAS强阳性，Sternberg细胞为阴性或弱阳性。（4）戈谢氏细胞强阳性，尼曼-皮克细胞阴性或弱阳性。（5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖原积分增高；一般的病毒感染，糖原积分在正常范围内。,六、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）,原理：细胞内的氯乙酸ASD萘酚酯酶（naphythol AS-D chloroacetate esterase,NAS-DCE）水解基质液中的氯乙酸ASD萘酚，产生ASD萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所存在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。NASDCE几乎仅出现在粒细胞，其特异性高，因此又称为“粒细胞酯酶”、“特异性酯酶”。,结果判断,阳性结果为胞质内出现红色沉淀（）胞质无色。（）胞质呈淡红色。（）鲜红色沉淀布满胞质。（）深红色沉淀充满胞质。,临床意义1急性粒细胞白血病和急性早幼粒细胞白血病原粒细胞NASDCE染色多呈（）（）。白血病性早幼粒细胞呈（）（）。2急性单核细胞白血病原、幼单核细胞多呈阴性反应。3急性淋巴细胞白血病 原、幼淋巴细胞呈阴性反应。,七、中性非特异性酯酶染色,原理：中性非特异性酯酶包括醋酸AS-D萘酚酯酶(naphytholAS-D acetate esterase,NAS-DAE)染色和-醋酸萘酚酯酶（naphythyol acetate esterase , -NAE）染色。细胞内的-醋酸萘酚酯酶（naphythyol acetate esterase , -NAE）在pH中性的条件下水解基质液中的-醋酸萘酚，释放出-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色，-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性酯酶。,结果判断,阳性结果为胞质内出现蓝色或棕黑色颗粒沉淀 （）无颗粒沉淀，为0分。（）颗粒少量、稀疏，为0.5分。（）胞质内1/2区域出现颗粒沉淀，为1分。（）胞质内3/4区域出现颗粒沉淀，为2分。（）胞质内布满颗粒沉淀，为3分。（）胞质内充满浓密的颗粒沉淀，为4分。,临床意义NASDAE染色属于中性非特异性酯酶染色，在鉴别白血病类型时需同时做NaF抑制试验。 1急性粒细胞白血病原粒细胞NASDAE染色可呈阳性反应，且不被氟化钠抑制。2急性早幼粒细胞白血病白血病性早幼粒细胞NASDAE染色为阳性或强阳性反应，亦不被氟化钠所抑制。3急性单核细胞白血病原、幼单核细胞NASDAE染色多呈阳性或强阳性反应，但能被氟化钠抑制,骨髓NAS-DAE染色及氟化钠抑制反应,细胞化学染色检验小结,几种常见急性白血病的细胞化学染色结果,各型急性白血病细胞的化学染色特征 POX PAS NASDCE NASDAE （NaF）NAP急淋（L1-L3 ） (-) (+)(+) (-) (-)(+) 不抑制 急粒（M1 M2） (-)(+) (-)(+) (+)(+) (-)(+) 不抑制急早幼粒（M3）(+)(+)(+)(+) (+)(+) (+)(+) 不抑制 急粒单（M4） (-)(+)(-)(+) (-)(+) (+)(+) 部分抑制 或急单（M5） (-)(+) (-)(+) (-) (+)(+) 抑制 或红白血病（M6 ） (-) (+)(+) (-) (-) 幼红细胞急巨（M7） (-) (+)(+) (-)(-） ,自学内容,骨髓活检细胞因子的检验造血细胞培养检验血细胞染色体检验和分子生物学检查细胞调亡,1.常用的化学反应种类不包括下列哪种A.偶氮偶联法 B.联苯胺法C.普鲁士蓝反应 D.中和反应 E.雪夫反应2.临床上辅助判断急性白血病类型首选最重要的细胞化学染色是A.特异性脂酶 B.非特异性脂酶 C.过氧化物酶D.中性粒细胞碱性磷酸酶 E.酸性磷酸酶3.特异性及非特异性脂酶的染色方法是A.偶氮偶联法 B.联苯胺法C.普鲁士蓝反应 D.中和反应 E.雪夫反应,4.鉴别小原粒白血