第21章 常用分子生物学技术的原理及应用-2011.ppt

选修课,利用乳腺生产药用蛋白的转基因羊,把白蛋白基因转入着乳腺中，这样，转入的白蛋白基因在羊乳腺中表达。通过其分泌不断产生白蛋白。通过分离、纯化，可以得到药用白蛋白，解决临床上病人对白蛋白的需求。,转入标记基因的转基因猴,这是一只转一个简单的标志基因恒河猴，名叫安迪（Andi）,目的就是能够简单地确认出它的基因图谱。虽然体内增加的仅是简单标志基因，但是同样的转基因方法可以令其它的实验动物携带特定的医疗目的基因。猴的基因编码与人类只有1%的差别，通过转基因猴，可以研究各种疾病对人的影响，并开发出相应的治疗方法。如引进老年性痴呆病的基因，加快针对这种疾病疫苗的开发研究。还可引进糖尿病、乳腺癌、帕金森氏症等基因，为人类最终战胜社些疾病提供帮助。,转基因猪进行人体器官移植,由于猪的器官，如心脏与人的大小和活动能力类似，且猪的数量充足，容易繁殖，可以充分满足临床需要，被医学界认为是人类器官移植的最佳提供者。在人体器官移植手术中，灵长类猿猴的内脏普遍为人们所看好。但医学研究发现，猿猴身上的一些病毒对人类十分有害。,第二十二章常用分子生物学技术原理ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication,第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridization各种肿瘤的生物学特性的判断;遗传病的基因异常分析。在感染性疾病方面主要有结核病、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV），甚至艾滋病等。,二、基因诊断常用技术方法,1.限制性酶切(rescrictionenzymedigestiton)2.聚合酶链反应(PCR)3.基因芯片(genechips)4.基因测序(DNAsequencing)5.核酸分子杂交(hybridization),1.限制性酶切(RFLP法),限制性内切酶谱分析法DNA限制性长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)分析等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO),限制性内切酶,DNA片段消化,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,限制性内切酶识别序列特点回文结构(palindrome),RLFP分析法,镰型红细胞贫血(SickleCellanaemia),Cause:,内切酶有特异的识别序列,如果基因突变发生在识别序列,酶切片段的长度就会改变。镰形细胞贫血症是由于链第6个密码子GAG突变为GTG，这一突变使原有的Mst酶位点消失。,Mst酶切位点(CCTNAGG),5,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,酶切后电泳结果分析,基因不同程度的缺失引起不同类型的地贫，基因缺失14个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个Gene时可得到10kb片段。,BamHI,BamHI,2,1,2,10kb,14kb,probe,地贫的Gene诊断,DNA指纹图谱分析,人体细胞有总数约为30亿个碱基对的DNA，每个人的DNA都不完全相同，人与人之间不同的碱基对数目达几百万之多，因此通过分子生物学方法显示的DNA图谱也因人而异，由此可以识别不同的人。所谓“DNA指纹”，就是把DNA作为像指纹那样的独特特征来识别不同的人。由于DNA是遗传物质，因此通过对DNA鉴定还可以判断两个人之间的亲缘关系。DNA鉴定技术是英国遗传学家AJ杰弗里斯（1950）在1984年发明的。由于人体各部位的细胞都有相同的DNA，因此可以通过检查血迹、毛发、唾液等判明身分。,只要罪犯在案发现场留下任何与身体有关的东西，例如血迹和毛发，警方就可以根据这些蛛丝马迹将其擒获，准确率非常高。DNA鉴定技术在破获强奸和暴力犯罪时特别有效，因为在此类案件中，罪犯很容易留下包含DNA信息的罪证。根据DNA指纹破案虽然准确率高，但也有出错的可能，因为两个人的DNA指纹在测试的区域内有完全吻合的可能。因此在2000年英国将DNA指纹测试扩展到10个区域，使偶然吻合的危险几率降到十亿分之一。,另一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形成杂交点。如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂交，为突变纯合子；如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，说明一条染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子；否则说明受检者不存在该种突变基因，,等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO),地中海贫血（地贫）发病机制是由于人体基因突变或缺失而导致与珠蛋白肽链合成速率的不平衡，从而引起的溶血性贫血。地贫按受累基因的种类分成不同的类型，其中常见的两种类型是和地贫。地贫分为最轻型、轻型、中间型及重型；地贫又分为轻、中、重型。,39地中海贫血是血红蛋白链基因第39位密码子的碱基由C变成了T的结果。先合成一条与正常链基因互补的19bp正常（CCTTGGACCCAGAGGTTCT，正常）的寡核苷酸链为探针；再合成一条与突变的链基因互补的19bp（CCTTGGACCTAGAGGTTCT，突变）的寡核苷酸链为探针。以上两探针分别与患者的DNA进行杂交，如果用正常探针杂交显影的结果呈阴性、而突变探针显影的结果呈阳性，可确诊患者为39地中海贫血。,2.PCR法,根据突变的基因序列设计探针,如扩增产物出现特异性带,说明携带致病基因;无特异性带出现则为正常。,特点:从极少样品即可扩增出肉眼可见的产物。,5,Primer1,5,Primer2,5,5,TemplateDNA,PCR基本工作原理,PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,30cycles,F基因内含BclI和XbaI多态性位点的两个DNA片段；含BclI多态性位点的DNA片段在F基因18外显子内，可产生99bp（碱基对）和43bp。若只产生142bp，说明不具BclI酶切位点的等位基因，与甲型血友病基因连锁；含XbaI多态性位点的DNA片段在F基因22内含子内，可产生68bp片段，若仅出现一条96bp的区带，说明不具XbaI酶切位点的等位基因，与甲型血友病基因连锁。,PCR/RFLP结合,PCR及其衍生技术,甲型血友病的基因诊断（连锁分析1）,5,3,引物1,引物2,99bp,43bp,BclI,因子VIII基因142bp片段,PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP)将PCR产物变性为单链后进行非变性（中性）聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变即可造成DNA单链构象的改变，进而导致电泳速率变化，从而检测出基因突变。1）单链核酸碱基-构象-电泳速率2）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,PCR-SSCP分析原理示意,高通量提高信息量,平行化提高信息的可比性,微量化降低待检样品用量,自动化提高工作效率,低成本可迅速普及推广,生物芯片的特征与优点,4.基因芯片技术,三、基因诊断的应用,遗传疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定,DNA指纹分析用于个体鉴定,癌基因和抑癌基因检测,如原癌基因K-ras第12、13和61位密码子点突变：GGT-TGT/GTT/GAT/GCT；抑癌基因p53密码子130290之间的基因突变,正常细胞H-ras基因碱基序列:ATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGGCGGTGTG肿瘤H-ras碱基序列:ATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGTCGGTGTG正常细胞p21蛋白的氨基酸序列:MetThrGluTyrLysLeuValValValGlyAlaGlyAlaVal肿瘤H-ras编码p21蛋白氨基酸序列:MetThrGluTyrLysLeuValValValGlyAlaValAlaVal,H-ras基因的点突变,SARS相关冠状病毒的基因诊断,2003年4月，香港研究者Peiris等报告了50例SARS病人的临床表现和病毒学研究结果。一种新的冠状病毒(Coronavirus)是SARS的致病原因。2003年4月，德国汉堡Bernhard-Nocht热带医学研究所学者Drosten等用随机扩增技术，获得一段长度为300bp的核苷酸序列。根据这段序列，建立了检测新冠状病毒的常规和实时定量PCR技术。,检测标本痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液、血浆、粪便。检测方法1.逆转录-巢式PCR(Reverse-NestedPCR)2.逆转录-实时PCR(Reverse-RealtimePCR),定义早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。,目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。,基因治疗,谢德尔，1999,美国医学家WF安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。,1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。,基因治疗的基本方法基因矫正(genecorrection)基因置换(genereplacement)基因增补(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation),五、基因治疗的应用,治疗恶性肿瘤例如，将已导入IL2基因的TIL细胞回输给病人，启动自身免疫，治疗黑色素瘤。美国已批准8种基因治疗方案。治疗艾滋病用射线照射已导入HIV基因的成纤维细胞，细胞停止分化，但能产生gp160，将细胞回输给病人，能激活免疫系统，杀伤HIV感染细胞。治疗家族性高胆固醇血症（FH）这是肝细胞低密度脂蛋白（LDL）受体基因混乱造成的遗传病，将LDL基因导入病人离体培养的肝细胞中，然后经导管注入门脉循环的血液中，进入肝细胞后表达相应的功能蛋白。,治疗先天性免疫缺陷综合症病人因缺少腺苷脱氨酶基因（ADA）导致T、B淋巴细胞发育不完全，功能障碍，造成严重免疫缺陷。将正常ADA基因经转录病毒转染进入白细胞，回输患者体内，ADA基因表达正常，患者ADA达正常值的25%。治疗B型血友病：将人凝血因子的cDNA经逆转录病毒转染到患者的成纤维细胞，再植入患者腹腔中。患者的凝血因子从7.1ng/ml上升到24.5ng/ml，其活性从2.9%上升到6.3%。病情明显好转，不需要输血治疗,几种常见的基因失活技术,反义核酸技术核酶技术三链技术干扰RNA技术,基因治疗的其他方法：如“自杀基因”的应用，基因疫苗等,反义核酸技术,反义核酸(antisensenucleicacid）：根据碱基互补的原理，用人工合成或生命有机体合成的特定互补的DNA或RNA片段(或其化学修饰的衍生物）与目的序列结合，通过空间位阻效应或诱导Rnase酶活性，在复制、转录、剪切、mRNA转运及翻译等水平上，抑制或封闭目的基因的表达。,（一）反义DNA,是人工合成的与待封闭基因的某一区段互补的正常或化学修饰的DNA片段，用来抑制或封闭这一基因的表达。,（二）反义RNA,是指核苷酸序列与其所调控的RNA序列互补的RNA序列。,（三）肽核酸,在特定的肽链上连接不同的碱基，形成肽核酸，能与其互补的DNA或RNA特异性结合，从而抑制或封闭基因表达。,1.为基因分析提供了更好的手段；,反义核酸的应用,2.在细胞或亚细胞水平上对基因表达进行定性和定量研究；,3.用于病毒病、肿瘤和遗传性疾病的基因治疗；,4.将反义RNA作为一种探针，用于对病毒基因的复制、转录及表达水平进行定性和定量研究，探讨病毒的致病机理。,二、基因治疗的基本程序,治疗性基因的选择,基因载体的选择,靶细胞的选择,基因转移,外源基因表达的筛选利用在体中的标记基因,回输体内,病毒载体非病毒载体,体细胞生殖细胞,间接体内疗法直接体内疗法,三、基因治疗的应用与展望,应用,展望,遗传性疾病、心血管