叶俏-血浆循环DNA在原发性干燥综合征和系统性红斑狼疮中的意义.ppt

血浆循环DNA在原发性干燥综合征和系统性红斑狼疮中的意义,风湿免疫科,背景,血浆循环DNA，它具有DNA双螺旋结构，与基因组的DNA核苷酸及碱基组成上基本一致，能代表生物学特性，在肿瘤上研究很多，在免疫性疾病中报道不多，尤其在干燥综合症中报道甚少。测定pSS、SLE血浆cDNA浓度值，旨在探讨cDNA在pSS及SLE中的意义。,对象和方法,pSS患者36例均符合2002年干燥综合征国际分类标准SLE患者（排除继发干燥综合征患者）共29例，诊断符合美国风湿病学会（ACR）1982推荐的SLE分类标准健康体检者30例排除感染、肝炎、结核、创伤、应激、严重的心血管及脑血管疾病急性期等可致cDNA升高的因素。,主要试剂和仪器,微量样品DNA提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司）LightCycler480(RocheDiagnostics)实时定量仪日立7060/70C70型生化仪（日本）。,观察指标,血浆cDNA血沉（ESR)，C-反应蛋白（CRP），免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM)SLEDAI，SSDAI，SSDDI,标本采集,取静脉血5ml置于EDTA抗凝管中，离心完全去除血细胞成分置干燥洁净冻存管中，-70C低温冰箱保存备检，统一检测。,血清DNA的扩增,PCR扩增管家基因GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）genbank：NM_001256799.1引物序列：PrimerForward：5-CTGGGCTACACTGAGCACC-3，PrimerReverse：5-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3，PCR产物长度186dp,血清DNA的扩增,扩增反应采用三步法PCR扩增标准程序：50循环数，第一步-预变性：9530秒，第二步-PCR反应：（50个循环）955秒，5530秒，7230秒。,标准品的制备,利用正常人血浆提取质粒，并检测质粒OD（吸光度）值，通过所得OD值计算核酸质量，利用跨内含子的基因GADPH的引物扩增样品，测得样品血清中核酸的具体含量，并对质粒进行10倍的梯度稀释，得到浓度相差10倍的一系列标准品备用,标准品的制备,利用各标准品扩增所得CT值与相应标准品浓度，得到样品模板量计算公式为：X=（Y-28.69235）/-3.62966（Y：Ct值，X：模板量），根据这个公式计算标本循环DNA含量,统计学处理,采用SPSS18.0软件对资料进行统计学分析，定性资料的比较采用2检验，定量资料表示,各组间比较采用单因素方差分析，相关分析定量资料采用Pearson相关分析；等级资料采用Spearman相关分析，P0.05表示差异有统计学意义。,结果,3组血浆循环DNA统计所得结果柱状图见图（纵坐标单位为ng/ml）,各组间cDNA值比较,注：3组两两比较：与SLE组比较aP0.05;与对照组比较bP0.05,表13组循环DNA浓度值(ng/ml)比较,pSS组各指标间的相关性分析,表2循环DNA浓度值与SSDAI,SSDDI等指标的相关性分析(r,n=36),注：表内为相关系数r,括号内为P值,*P0.05,*P0.01。,pSS组cDNA与SSDAI相关性分析,pSS组cDNA与IgG相关性分析,SLE组各指标间的相关性分析,cDNA浓度值与SLEDAI、ESR、CRP、免疫球蛋白等指标无相关性.,讨论,循环DNA，又称为游离DNA，正常人血浆血清中存在微量游离DNA，来源于各条染色体的片段数与该染色体的大小有关，片段中内含子、外显子、插入序列的比例与全基因组构成比相似，因此循环DNA与疾病密切相关。,SuzukiN，KamatakiA，YamakiJ，ela1CharacterizationofcirculatingDNAinhealthyhumanplasmaJClinChimActa，2008，387;55-58,讨论,在pSS,SLE中循环DNA的升高,与对照组比均有显著差异（P0.05）循环DNA的升高的原因：1：可能与细胞的凋亡坏死、活性细胞的产生、DNA片段的产生及清除不平衡等有关。在鼠的模型中，细胞的凋亡和坏死已经被证实是血液循环DNA产生的主要机制。,PisetskyDS,JiangN.ThegenerationofextracellularDNAinSLE:theroleofdeathandsexJ.ScandJImmunol,2006;64:200-204,讨论,2：在自身免疫性疾病活动中，T细胞和或B细胞自主的克隆，B细胞的自动反应、T细胞的克隆和巨噬细胞产生自身免疫性抗体、大量可溶性炎性分子及细胞表面的蛋白质，这些物质能引起病理生理的紊乱，产生高选择性的DNA，类似于在肿瘤中产生的机理。,讨论,3：在死亡细胞的清除过程中产生了DNA，而补体系统能够加速死亡细胞的清除，因此有人认为在SLE患者中，对死亡细胞的自身免疫应答的产生及补体的消耗也是造成循环DNA升高的一种可能的机制。,PisetskyDS.DNAasamakerofcelldeathinsystemiclupuserythematosusJ.RheumDisClinNAm,2004;30:575-587.PisetskyD.TheimmuneresponsetocelldeathinSLEJ.AutoimmunityRev,2004;3:500-504.,讨论,在3组中，pSS组患者cDNA最高,其原因目前不是很明确，在pSS患者中细胞的凋亡也许是形成循环DNA升高的主要因素，是否有其他途径参与cDNA合成，有待进一步研究。,EBartoloni,VLudovini,AAlunno1,et,al.IncreasedlevelsofcirculatingDNAinpatientswithsystemicautoimmunediseases:ApossiblemarkerofdiseaseactivityinSjgrenssyndromeJ.Lupus,2011,20,928935.,讨论,结果表明pSS组中cDNA值与疾病活动度（SSDAI）成正相关性（r=0.551，P0.01），并且与IgG成正相关性，这可能由于疾病活动中细胞凋亡增多，