常用分子生物学技术的原理及应用

常用分子生物学技术的原理及应用The popular technology in molecular biology: principle and application,第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular hybridization & blotting technology,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间形成杂化双链的这种现象。,一、分子杂交与印迹技术的原理,杂交的原理实质是核酸分子的变性与复性过程,复性,RNA,DNA,（一）印迹技术,1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用,Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517.,原始文献出处：,（一）印迹技术,1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用,琼脂糖分离的DNA片段 变性为单链 将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾 利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到NC膜上，使之成为固相化分子。,载有DNA单链分子的NC膜可在杂交液与另一种DNA或RNA分子（探针）杂交，具有互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的DNA分子上，经检测分析可显现出杂交分子的区带。,2. 印迹(blotting)定义,将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。,3. 应用,广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测,4. 发展,电转移印迹技术、真空吸引转移印迹等,（二）探针技术,探针(probe)的概念,是带有特殊可检测标记（放射性核素、生物素或荧光染料）的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用来检测核酸样品中是否存在某一特定的基因。,探针的种类,寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针,将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。,探针技术的概念,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术 (Southern blotting),（二）RNA印迹技术 (Northern blotting),（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting),（一）Southern blotting,转移缓冲液,Whatman滤纸,凝胶,Whatman滤纸,纸巾,玻璃板,重物,与探针同源杂交的基因DNA片段,基因组DNA,DNA酶切片段,NC或尼龙膜,NC膜或尼龙膜,基因组DNA的定性与定量分析。 如对在基因组中特异基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。,Southert blotting用途,放射自显影照片,（二）RNA印迹技术(Northern blotting),相同点：,Alwine JC, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper（重氮苄氧甲基纸） and hybridization with DNA probes.Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354,原始文献出处,名称相对于Southern blotting,转移的是RNA转移前无需酶切转移效率较高变性方法,不同点,原理均为毛细作用。,（二）RNA印迹技术,Northern blotting 用途 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA 的表达水平。 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。,Northern blotting结果,由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟以上两种技术应用的越来越少,（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹),首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。,与DNA和RNA印迹相似之处,蛋白质的转移只有靠电转移。蛋白质的检测以抗体作探针。用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。,与DNA和RNA印迹不同之处,Western blotting应用,检测样品中的特异蛋白质的存在。 细胞中特异蛋白质的定量分析。 蛋白质分子的相互作用研究。,辣根过氧化酶（HRP）使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。,Western blotting应用,SDS-PAGE purified recombinant human CK2(重组人酪蛋白激酶2) subunit and its Western blotting,用已知的特异抗体检测目的基因蛋白,重组人酪蛋白激酶2,三种印迹技术的比较,斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA芯片技术 (DNA chip),其他印迹技术,斑点印迹 (dot blotting),A Dot blot is a technique in molecular biology used to detect biomolecules. It represents a simplification of the northern blot, southern blot, or western blot methods. In a dot blot the biomolecules to be detected are not first separated by electrophoresis. Instead, a mixture containing the molecule to be detected is applied directly on a membrane as a dot. This is then followed by detection by either nucleotide probes (for a northern blot and southern blot) or antibodies (for a western blot).,The technique offers significant savings in time, as chromatography or gel electrophoresis, and the complex blotting procedures for the gel are not required. However, it offers no information on the size of the target biomolecule. Furthermore, if two molecules of different sizes are detected, they will still appear as a single dot. Dot blots therefore can only confirm the presence or absence of a biomolecule or biomolecules which can be detected by the DNA probes or the antibody.,原位杂交 (in situ hybridization),In situ hybridization (ISH) is a type of hybridization that uses a labeled complementary DNA or RNA strand (i.e., probe) to localize a specific DNA or RNA sequence in a section of tissue, or, if the tissue is small enough, in the entire tissue. DNA ISH can be used to determine the structure of chromosomes. Fluorescent DNA ISH (FISH) can, for example, be used in medical diagnostics to assess chromosomal integrity. RNA ISH (hybridization histochemistry) is used to measure and localize mRNAs and other transcripts within tissue sections or whole mounts.,A：正常细胞，两绿两红. B：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号，一绿一红两融合.D：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号，两红两绿一融合，这由于异常染色体上面的BCR和ABL基因分离造成的.E：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号和一个额外的Ph 染色体。一红一绿三融合.,DNA芯片,将多种已知序列的DNA排列在一定大小的固相支持物上用于检测细胞或组织样品中的核酸种类的技术。,第 二 节 PCR技术的原理与应用,（Polymerase Chain Reaction，PCR）,聚合酶链反应,PCR技术是1985年由美国科学家Kary B Mullis建立的体外扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等突出优点，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举。,PCR方法被美国Science杂志评为1989年的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶被评选为象征1989年的“年分子”(the molecule of year)。,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry,Michael Smith,La Jolla, CA, USA,Kary B. Mullis,University of British Columbia Vancouver, Canada,for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method,for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、PCR技术的工作原理,模板DNA 特异性引物耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR体系基本组成成分,PCR反应循环,变性95C左右,延伸适温,退火Tm-5C,经过30个左右的循环后，PCR的扩增倍数为(1+x)n, x=75%, n为循环数.,2. 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段。,3. 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。,4. 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因。,1. 与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。,二、PCR技术的主要用途,（一）目的基因的克隆,（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析,二、PCR技术的主要用途,三、几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术 (RT-PCR)（二）原位PCR技术 (ISP)（三）实时PCR技术 (real time PCR),RT-PCR技术,AAnA,TTnT 5,5,mRNA,反转录酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶S1,双链cDNA,3,5,3,5,5,加热变性,加入特异性引物,DNA聚合酶,PCR,扩增出大量的产物,原位PCR技术 (ISP),原位PCR技术就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。 PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环，将引物引导下的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列（一般能扩增106倍），很容易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR技术具有灵敏度高，特异性强的优势，随着热循环自动化的提高与稳定也使得PCR技术的操作简便易行。但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型。,原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来，保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。,multidrugresistanceassociatedprotein,实时PCR技术 (real time PCR),常规PCR反应中产物以指数形式增加，在比较不同来源样品的DNA或cDNA含量时，产物的堆积将影响对检测样品中原有模板含量差异的准确判断，因此只能作为半定量手段应用。实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。Realtime PCR 常用的两种方法分别为SYBR green（荧光染料掺入法）和Taqman probe （探针法）。,SYBR green（荧光染料掺入法）,在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增 强到1000倍以上。 2、通用性好，不需要设计探针，方法简 便，省时，价格低廉。 3、通用型方法，在国内外科研中普遍使 用。 4、高通量大规模的定量PCR检测。 5、专一性要求不高的定量PCR检测。,此方法适用于：,Taqman probe （探针法）,PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,探针法技术原理,1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。 2、适用于扩增序列专一的体系的检测。 3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。 4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。 5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。,此方法适用于：,第 三 节核 酸 序 列 分 析Nucleic acid sequence analysis,核酸序列分析的基本原理,化学裂解法 (Maxam-Gilbert法),DNA链的末端合成终止法 (Sanger法),一、化学裂解法(Maxam-Gilbert法),基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。,(Sanger双脱氧链终止法),HO P O P O P O CH2,O,A, C, G or T,1,3 ,OH,5 ,双脱氧核苷三磷酸,脱去,二、DNA链末端合成终止法,Sanger 1958年和1980年两次获Nobel奖,The Nobel Prize in Chemistry 1980,for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA,for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids,Paul Berg,Walter Gilbert,Frederick Sanger,1/2 of the prize,1/4 of the prize,1/4 of the prize,Stanford University Stanford, CA, USA,Harvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USA,MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom,三、DNA自动测序,用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。通过4种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,目前所用自动测序技术同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳,多色荧光标记毛细管电泳,单色荧光标记平板电泳,同位素标记平板电泳,A,C,G,T,测序图谱,T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T,DNA测序仪示意图,computer analysis,凝胶中DNA移动方向,样品槽,激光器,输入光学系统,成象透镜,聚焦透镜,高灵敏度相机,旋光镜/棱镜组件,DNA自动测序结果举例,ABI PRISM 310型 DNA测序仪,目前所用测序技术的缺点,1、测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所测序列不可能太长，目前为1000个核苷酸左右。2、测序反应费时费力 科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的时间，耗费了30亿美元的费用。3、测序准确度不高 DNA聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误。4、测序基于PCR反应，需要引物，并且有些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。,下一代测序技术,下一代测序技术又称为二代测序技术，其代表技术为罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roche GS FLX sequencer), Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。,特点,测序策略主要基于循环芯片测序法（Cyclic-array sequencing），即制备DNA文库，单分子扩增，在固相载体上形成DNA簇阵列，并行地利用DNA聚合酶或者连接酶进行酶促反应（模板变性、引物退火杂交、延伸或连接），同时读取反应产生的特异性荧光信号，最终得到超大量的DNA序列信息。 高通量并行测序。例如，Roche GS FLX sequencer一次就可对上百万条DNA分子同时进行序列测定，一次运行通量达到400Mb以上，而传统测序（一代测序）一轮测序的通量仅为80Kb左右。 单分子测序。传统测序（一代测序）是对多个DNA分子的混合物进行测序，其测序结果是多个DNA分子综合的序列信息；而二代测序先对单个DNA分子进行PCR以放大DNA分子数量（相当于单个DNA分子的克隆复制），再对这些DNA分子进行测序，就可以得到原来单个DNA分子的序列信息。,新型纳米孔测序法,新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对于长达1,000个碱基的单链 DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。如果对现有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术（也可称为下、下一代测序技术），从而帮助人们实现24小时内只花费 1,000美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。,基 因 文 库Gene Library,第 四 节,基因组DNA文库 (genomic DNA library)cDNA文库 (cDNA library),基因文库 (gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,一、基因组DNA文库,基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。,用于构建基因组文库的载体有噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。,cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。,二、cDNA文库,第 五 节 生 物 芯 片 技 术,Biological chip technology,是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。,一、基因芯片,基因芯片(gene chip),将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质芯片(protein chip),The worlds highest-density protein microarray, carrying 22,000 human proteins,第六节,生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,一、蛋白质相互作用研究技术,各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）酵母双杂交荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选,常用蛋白质相互作用的研究技术,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。,（一）标签蛋白沉淀,标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。,方法原理,该方法利用一种带有特定标签（tag）的纯化融合蛋白作为钓饵，在体外与待检测的纯化蛋白温育，然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，洗脱液经电泳分离并染色。如果两种蛋白有直接的结合，待检测蛋白将与融合蛋白同时被琼脂糖珠沉淀（pull-down），在电泳胶中见到相应条带。,标签融合蛋白沉淀实验流程示意图,GST pull-down assay,其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”。目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)。洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行，操作方便。,Schematic of pull-down assay using bacterial expression of bait protein and cell-free expression for the prey protein.,（二）免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）,免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。,原理,当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。,实验流程示意图,实验流程为： （1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4C， 最大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1g相应的抗体加入到细胞裂解液，4C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10l protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min； （4）将预处理过的10l protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连； （5）免疫沉淀反应后，在4C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗34次；最后加入15l的2SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟； （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。,优缺点,优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。,GST pull-down assay 与Co-immumoprecipitation 联合应用举例,（三）酵母双杂交技术（yeast two-hybrid system）,酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。 该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。,1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。,1 酵母双杂交系统的建立,该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与，真核生物转录因子含有两个不同的结构域：,这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。,Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。 两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的1147位多肽构成，能识别位于Gal4效应基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。此外，在其N-端还具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768881位多肽构成。 当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。,Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。 其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以相互作用的。,当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近, 形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。 Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS，并可与之结合； Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活UAS下游报告基因LacZ的转录。,酵母转录因子（Gal 4）,与BD-fusion -诱饵（bait）与AD-fusion -猎物或靶蛋白（prey or target protein）,报告基因（reporter gene） -Lac Z（编码-半乳糖苷酶）,2 酵母双杂交系统的原理,X-Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的显色底物，在-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物，所以可以轻易的检测出LacZ基因的表达。,表达“诱饵”和“猎物”蛋白； 检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。,3 酵母双杂交系统的基本策略,4 酵母双杂交系统的优点,（1） 高敏感性 采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达； 激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定； 通过mRNA使信号放大； 检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。,（2）真实性 检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（3）简洁性 融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。（4）广泛性 采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。,分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。 用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新的相互作用蛋白。 分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。 绘制蛋白质相互作用系统图谱,5 酵母双杂交系统的应用现状,例如：利用酵母双杂交发现新的相互作用蛋白质,将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。,电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经