《DNA复制和修复》PPT课件.ppt

1,第三十四章DNA的复制和修复,3,分子生物学的中心法则(centraldogma)DNARNA蛋白质,复制,转录,翻译,逆转录,RNA复制,4,一、DNA复制的基本原则（特点）（一）半保留复制（semiconservativereplication）,模板原则特点,亲代DNA双链，每股链都可作为模板按碱基配对原则指导新链合成合成的两个子代DNA分子碱基顺序与亲代分子完全一样一条链来自于亲代的DNA链，另一条链是新合成的链,5,亲代DNA,子代,子代,半保留复制,新链,6,Oldstrand,Newstrand,ThehypothesisofsemiconservativereplicationproposedbyWatsonandCrickin1953.,7,Radioisotopelabelinganddensitygradientcentrifugationclearlydistinguishesreplicationsofsemiconservativefromconservative.（1958）,8,9,10,11,AelectronmicrographofthereplicationintermediateofaplasmidDNA:-shapedstructureswereobserved;nosinglestrandedDNAisvisible.,Nocompleteunwindingofthetwoparentalstrandsoccurredbeforethedaughterstrandsaresynthesized,12,（二）半不连续复制（semidiscontinuousreplication）1、体内仅存在53的DNA聚合酶2、前导链与随从链（岗崎片段）,13,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,半不连续复制,14,前导链（leadingstrand）：DNA复制时，一股以35方向的母链作为模板，新合成的链以53方向连续合成的链称为前导链。（复制方向与解链方向一致）,15,随从链（laggingstrand):DNA复制时，一股以53方向的母链作为模板，新合成链沿53合成1000-2000个核苷酸不连续的小片段称为随从链。（复制方向与解链方向相反),岗崎片段（Okazaki）,岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链,16,DNA半不连续复制：35方向母链为模板，新链53方向连续合成53方向母链为模板，新链53方向合成许多不连续的片段（岗崎片段）这种复制方式称之为半不连续复制。,17,（三）RNA引物,DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP在DNA模板上聚合需要具3-OH的引物,RNA聚合酶能催化两个游离NTP在DNA模板上聚合提供3-OH引物最后被DNA聚合酶除去、补满，再由连接酶连接,减少突变，提高DNA复制的真实性,18,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,RNA引物,3-OH,19,（四）复制的真实性严格的碱基配对规律RNA引物聚合酶的选择作用复制时有即时的校读功能35外切酶功能DNA损伤的修复机制,20,二、参与DNA复制的酶类和蛋白质,DNA链合成的条件dNTPMg+3-OH引物DNA模板酶和蛋白质因子,21,酶和蛋白质因子DNA聚合酶/解旋酶单链结合蛋白(SSB）拓扑异构酶/引发体DNA连接酶,22,23,24,（一）DNA的聚合反应,25,26,（二）大肠杆菌DNA聚合酶（原核生物）,3,5-磷酸二酯键,3,5,图12-4,27,DNA聚合酶多功能酶53外切酶35外切酶53聚合酶单链多肽（Zn2+）大小二个片段切除RNA引物，填补空缺损伤后修复,DNA聚合酶多功能酶53聚合酶35外切酶不对称二聚体单体1-前导链/单体2-随从链DNA复制的主要酶高续进性高聚合酶活性高产物真实性,28,29,3553外切酶聚合酶,N,C,53外切酶,小片段,大片段（klenow片段）,切除RNA引物损伤修复,校读功能,（常用的工具酶）,1、DNA聚合酶（DNAPolymerase）Kornberg酶、DNA指导的DNA聚合酶（DNA-DirectedDNAPolymerase,DDDP）,聚合功能,30,Large（Klenow）fragmentofDNApol,31,32,34,DNApol仅参与局部修复，不是真正的复制酶合成速度太慢持续合成能力低影响DNA复制的基因突变与DNApol无关,35,2、DNA聚合酶全酶（DNAPolymeraseholoenzyme）,10种亚基组成，含锌2(4个)DNA聚合酶全酶,核心聚合酶连接两个核心聚合酶夹钳装置复合体星环状,容纳DNA双链,Slidingclampsubunits,聚合酶活性,聚合酶活性,35外切活性,复合物，促进亚基结合于DNA,DNApolIII（复制酶）,无5-3外切酶活性组成核心酶,促进核心酶形成二聚体,组装,2,38,39,40,真核细胞的DNA聚合酶,五种DNA聚合酶DNA聚合酶和PCNADNA聚合酶DNA聚合酶、,引物的合成前导链、随从链合成参与线粒体DNA的合成参与DNA的修复,增殖细胞核抗原（类似于亚基）,41,3、DNA聚合酶、,DNA聚合酶53聚合酶活性35外切酶活性DNA聚合酶和DNA受严重损伤时诱导产生跨越受损部位使复制缺乏准确性,（修复酶）,42,（三）DNA解旋酶及SSB,DNA解旋酶（helicase）单链结合蛋白(SSB）,解开DNA双链每对碱基消耗2个ATP维持单链状态(镇纸)使其不受核酸酶水解避免单链DNA自身发夹螺旋形成使前端螺旋易解开,大肠杆菌SSB与DNA结合具有协同效应,43,（四）DNA拓扑异构酶,Linkingnumber,两条链的互绕数,44,45,46,47,48,50,51,含拓扑异构酶（及H1）与DNA复制及转录有关,52,53,拓扑异构酶/（topoisomerase）拓扑异构酶/旋转酶（gyrase）,切断DNA双螺旋中一股，张力下降后封闭消除负超螺旋不需能量切断DNA双链引入负超螺旋需ATP供能,1、大肠杆菌的拓扑异构酶,54,磷酸二酯键的转移,55,56,57,58,拓扑异构酶拓扑异构酶类型：切断DNA双螺旋中一股；不需能量拓扑异构酶/,消除正/负超螺旋消除负超螺旋消除正/负超螺旋不能导入负超螺旋,2、真核细胞的拓扑异构酶,59,（五）引发体（primosome）,蛋白质DnaADnaB引物合成酶,结合到DNA双链复制起始部位(需ATP)解链酶的作用合成RNA引物,RNA引物的合成是复制起始所必需的,61,（六）DNA连接酶,催化二段DNA链之间3,5磷酸二酯键的形成,3OH,5,5,3,OO-POO-,有缺口的DNA链,DNA连接酶,ATP,AMP+PPi,OOPOO-,5,3,缺口封闭,62,63,64,65,缺口填补:连接双股DNA分子中一链的切口双链DNA分子中双链的切口不能连接二分子单链DNA,66,应用:（1）岗崎片段之间的连接（2）DNA损伤修复中的连接（3）一种重要的工具酶:限制性内切酶切割后形成的粘性末端或平头末端的连接,67,68,三、DNA复制的过程(起始、延伸、终止）,确定复制的起始点解开双链DNA,提供单链DNA模板形成复制叉DNA合成的起始和延长形成带有新合成的DNA片段的复制泡复制的终止,69,原核生物双向复制（型复制）特定起始点：oriC,真核生物多个复制单位（复制泡）（复制起始点+复制叉）多个起始点,（一）复制的起始,70,大肠杆菌复制起始点oriC的结构,（1）9个核苷酸的重复序列4个,（2）13个核苷酸的重复序列3个,71,形成起始复合物,72,DNA的甲基化与复制的发动有关,Oric中含11个GATCDam甲基化酶使A上N6甲基化（亲代）半甲基化的Oric可与细胞膜结合,73,原核生物双向复制（型复制）,74,真核生物复制泡（复制起始点+复制叉）,76,DNA双链复制起始点,dnaA,dnaB/dnaC,DNA双链解开成单链DNA,SSB,引物酶,RNA引物/3-OH,DNA聚合酶,dNTP,和3-OH形成35磷酸二酯键,解旋酶,SSB,SSB,3,3,5,5,引发体,解旋酶,拓扑异构酶,77,（二）复制的延伸1.DNA聚合酶的作用2.前导链合成1000-2000个核苷酸后，3.随从链开始合成，岗崎片段的长度为1000-2000个（大肠杆菌）4.Pol为不对称二聚体：一个作用于前导链另一个作用于随从链(loop),78,后滞链中引物不断被合成,79,80,81,82,84,85,3,86,87,（三）复制的终止,去除RNA引物补充空缺连接,DNA聚合酶的小片段53外切酶DNA聚合酶的大片段35外切酶53聚合酶DNA连接酶,88,3,5,5,3,89,90,91,（四）真核细胞端粒DNA的复制,1.端粒(telomere)真核生物的线性染色体DNA每复制一次，子链5有缺失末端有特殊序列-端粒特征:由数百个串联重复的6核苷酸组成人:5-AGGGTTAGGGTT-3端粒能稳定染色体,92,二十世纪三十年代，遗传学家BarbavaMcClintock和HermannJ.Muller发现，染色体的末端有一种能稳定染色体结构和功能的特殊成分。如缺少染色体间会互相粘连、出现结构变化或其它错误行为，以致影响染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞的存亡。,“端粒”（telomere）,希腊语末端“telos”和部分“meros”端粒telomere,端粒帽染色体端粒帽,1978年首次发现四膜虫端粒的分子组成：,端粒染色体DNA端粒,人端粒的分子组成：,95,线形DNA复制末端问题,3,5,5,3,RNA引物水解,端粒染色体DNA端粒,97,2.端粒酶（telomerase)组成蛋白质(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板)唯一携带RNA模板的逆转录酶人端粒酶:模板(RNA-端粒酶):3-CAAUCCCAAUC-5合成(DNA):5-AGGGTT-3端粒酶和衰老、肿瘤有关,3、端粒酶的作用机制,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,2.聚合,1.结合,3.移位,爬行模式,端粒酶的功能,TTGGGG,TTGGGG,末端补齐机制：,5,GGGGTT,（GGGGTT）n,端粒酶,5,3,5,DNA聚合酶,101,102,103,以延长的DNA单链为模板,3-OH为引物合成富含C的互补链,端粒帽染色体DNA端粒帽,n（CCCCAA）（TTGGGG）n,n（GGGGTT）（AACCCC）n,3,5,端粒结合蛋白,保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用一般是紧密的非共价键结合,106,哺乳动物中端粒末端形成大的环状结构,环状DNA+蛋白质保护染色体末端的稳定,端粒的环状结构,107,端粒酶与细胞存亡,端粒酶催化端粒不断延长，从而抵消因染色体复制、细胞分裂导致的DNA缩短，使得染色体DNA完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。,正常细胞：,细胞分裂,细胞分裂,衰老死亡,细胞年轻化,抗衰老,染色体DNA,端粒,端粒,111,四、DNA的损伤与修复DNA修复的基础：一条链有损伤修复酶切除以未损伤的链为模板合成原来相同的序列,112,113,（一）造成损伤的原因,自发因素物理因素化学因素,紫外线损伤（共轭双键）电离辐射损伤（X线/线）亚硝酸盐CU5-溴尿嘧啶5-BUA氮芥类烷化剂羟胺C-A,G,G,羟胺,DNA自发损伤DNA复制时碱基的错误配对罕见态碱基引起T-G、A-C错配,NHN,NHN,N,N,N,N,N,N,N,N,OHO,OHNH,OHO,OHNH,CH3,CH3,烯醇式T,酮式G,酮式T,烯醇式G,T-G错配,C-A错配,NHN,NHN,HNHNH,HNHNH,N,N,N,N,N,N,N,N,O,O,亚氨基式C,亚氨基式A,氨基式A,氨基式C,环出效应引起碱基错配,新合成链TGGCTGGCATGGCAATG模板链ACCGATAGACCGTAGACCGATAG,A,lllllllllllllllll,环出效应引起碱基缺失或插入新合成链TTTTTTTTTTTTGAC模板链AAAAACTGAAAACTGAAAACTG,lllllllllllllll,A,A,新合成链TTTTTTTTTTTTGAC模板链AAAAACTGAAAACTGAAAAACTG,T,T,lllllllllllllll,117,118,119,120,121,122,羟胺（hydroxylamine，HA）使C的化学成分发生改变，不能与G配对，而与A互补。经两次复制后，C-G对变换成T-A对。,123,（二）修复机制,1、光修复（低等生物）不需光复活酶需光复活酶,（photoreactivationrepair）嘧啶单体嘧啶二聚体嘧啶单体嘧啶二聚体光复活酶（+）蓝光,280nm,239nm,124,光复活/光修复光复活酶识别TT与之形成复合物吸收光能使TT解开成为单体酶从复合物中释放仅作用于UV形成的产物,125,O6甲基鸟嘌呤直接被修复,126,2、切除修复（excisionrepair）（1）UV特异核酸内切酶切除DNA聚合酶填补、修复DNA连接酶连接（2）人体重要的修复方式（3）缺乏UV特异核酸内切酶着色性干皮病,切除修复发生在复制之前,核苷酸切除修复,128,dUTP酶可以分解dUTP为dUDP和dUMP胞嘧啶C自发脱氨氧化生成尿嘧啶U尿嘧啶-N-糖苷酶,腺嘌呤脱氨成次黄嘌呤次黄嘌呤-N-糖苷酶烷基化修饰的碱基被糖苷酶除去,AP位点（apurinic/apyrimidinicsite）,129,碱基切除修复,DNA糖苷酶识别切除改变的碱基核酸内切酶切除磷酸二酯键DNA聚合酶填补DNA连接酶连接,130,DNA糖苷酶具特异性识别-DNA中的异常碱基水解-异常碱基与脱氧核糖间糖苷键使其脱落,131,132,DNA碱基的组成为何是“T”？（1）DNA中的C容易突变成U（2）尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U（3）若DNA中存在U，无法区别突变U和正常UDNA中T的存在增加遗传信息的稳定性RNA中的U：数量多/半衰期短/经济,134,135,3、错配修复耗能的过程,136,137,DNA错配修复的模型,140,4、重组修复（recombinationalrepair）,141,二聚体后起始途径复制继续子链缺口经重组由母链相应片段填补RecA蛋白具有交换DNA链活力母链缺口再合成二聚体未被去除而是逐渐被稀释,复制后修复,142,5、易错修复,DNA受到损伤或复制系统受到抑制SOS反应诱导修复系统：避免差错的修复（errorfreerepair）易错修复（errorpronerepair）,143,SOS反应诱导缺乏校对功能的DNApol、引起校对系统的松懈RecA基因产物LexA蛋白自身水解（蛋白酶活性被激活）SOS系统开放：修复系统的酶表达,LexA基因表达也增加使SOS反应可迅速逆转,144,145,146,五、DNA突变（一）突变的类型,点突变类型结果,转换-同型碱基颠换-异型碱基启动子/剪接信号影响整个基因功能编码序列蛋白质功能改变中性变化AA变化，功能不变静止突变碱基变，AA不变,147,缺失插入倒位,一个碱基/一段核苷酸/整个基因一段原来没有的碱基/核苷酸序列DNA链内部重组，一段方向颠倒,148,149,（二）诱发基因突变的因素,根据突变发生的原因可将突变分为:自然条件下未经人工