病毒包装实验整体流程及原理

病毒感染细胞实验的整体过程和原理目的基因没有直接集成到大部分真核细胞中，通常是用病毒包装目的基因，感染细胞，获得符合实验要求的表达。1、病毒类型病毒种类很多，常见的是慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理伦蒂病毒是一种逆转录病毒。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体与化学合成的siRNA或基于瞬时表达载体的普通siRNA载体相比，增强了替代瞬时表达载体的使用，而Lentivirus-siRNA克隆可用于感染难以依赖传统转染试剂的细胞株，例如被慢病毒包装系统包装后的原代细胞、悬浮细胞、无分裂状态的细胞。1.1.2特性1)直接包装为假病毒粒子，对分裂和未分裂的细胞都有感染效果，适用于RNAi研究或体内实验中难以转染的细胞(例如神经元细胞、干细胞或其他原代细胞)。(2)通过简单的方法，就可以获得稳定表达特定基因的多个细胞株。(。3)可用于敲除、基因治疗、转基因动物研究。4)不需要转基因试剂，操作方便。5)根据客户的要求，可以准备各种标记。1.1.3慢病毒包装摘要流程：1)含有目标基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建及质粒纯化提取。2)慢病毒载体、包装系统感染病毒包装细胞293T等。(3)培养约48hrs-72hrs，提取含有病毒的上等培养液。(。4)病毒的纯化和富集。5)化妆，-80 保存。6)公布逆量化目的基因验证和测试报告。1.2，腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种不依赖宿主细胞分裂的克隆DNA病毒。有近50种血清型，大部分Ad携带者以血清素2和5为基准，通过基因操作替代E1和E3基因，降低了病毒的复制能力。这种重组病毒仅在高度表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是适合治疗的高效控制系统。1.2.2特性1)几乎可以感染任何类型的细胞(2)可以获得复制缺陷类型(缺少E1和E3)的腺病毒(3)病毒滴度很高，生成病毒达到1012 PFU/mL，可以有效增殖。(4)腺病毒载体感染宿主的范围比较大，制造容易，操作简单。(5)感染细胞时不整合到染色体中，没有激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。1.2.3腺病毒包装摘要过程1)表达siRNA/miRNA的腺病毒载体的构建2) PacI消化精制质粒。(3)消化良好的腺病毒表达载体转染293A细胞，收获细胞，制造病毒粗提物。4)将病毒粗萃取物感染293A细胞，放大病毒。5)化妆，保存到-80 。1.3、慢病毒和腺病毒比较慢病毒矢量系统与腺病毒矢量系统的比较病毒表达系统慢病毒表达系统(Lentivirus)腺病毒表达系统(腺病毒)病毒基因组RNA病毒双链DNA病毒复制自主复制自主复制是否合并病毒基因组整合到宿主基因组中，长期稳定地表达外源基因病毒基因组在宿主基因组中获得自由，外源基因瞬间表达受感染的细胞类型分裂和未分裂细胞的感染适合于像神经细胞一样难以转染的初级细胞和体内实验感染分裂和未分裂的细胞表达丰富中等级别表达高级表达表达时间慢(1-3天)快速(1-2天)占卜效价最高10*8pfU/ml效价最高10*11pfU/ml克隆容量可以插入小于8kb的外部代码段，该代码段长度会随着插入段长度的增加而减少您可以插入最大8kb的外部片段，该外部片段会随插入段长度的增加而减少免疫原性低免疫原性高免疫原性2、在载体上构建目标基因2.1实施手段克隆方法通常取决于原始质粒信息，有两种方法：(1)如果原质粒具有与载体一致的酶切部位，则利用该内部酶切掉该片段，将其回收、连接到载体上，分解酶，确认碱基序列2)如果没有匹配的酶部位，则设计具有特殊关节的引物，进行PCR扩增，获得目的片段，然后用相应的enselatop剪切该片段，再利用，连接穿梭载体、酶切和测序鉴定？-嗯？-嗯？-嗯？2.2质粒载体2.2.1概念构成原核生物的微型器官(主要指线粒体和叶绿体的细胞)和除细菌细胞细胞核外的环脱氧核糖核酸(DNA)分子，都是可自我复制的环状DNA双链结构2.2.2功能质粒中有很多抗生素耐药基因，如四环素耐药基因或卡那霉素耐药基因。有些称为附着体的质粒可以整合到真菌的染色体中，也可以成为染色体上自由的DNA分子。质粒可以在宿主细胞内外复制。通过这些特性，可以在质粒上制造一些目的DNA片段，转化成大肠杆菌，选择培养培养基，持续复制，获得目的产物。3，质粒DNA在大肠杆菌中转化连接目标基因的质粒转化为大肠杆菌是目的基因在大肠杆菌内扩增后提取质粒。接下来是质粒DNA在大肠杆菌中转化的三个阶段。3.1大肠杆菌受体细胞的制备(1)在大肠杆菌板中选择3mlLB培养基的一个试管，在37 下进行通宵振动培养。2)将0.4毫升的菌液拿到40毫升的液体培养基中，在37 下进行23h的振动培养3)菌液转移到50毫升离心管，放在冰上10分钟左右4)4离心10分钟(4000r/min)5)倒入培养液，倒立排水孔，培养输液6)沉淀为冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞后，立即冰浴30分钟7)4离心10分钟(4000r/min)8)倒入上等液，冰浴的0.1毫升/L氯化钙2毫升悬浮细胞(放在冰中)9)化妆细胞，200ul 1份，保存到4 3.2质粒DNA的转化1)取200ul新鲜制成的感形势炮，加入质粒DNA2ul，均匀混合。冰浴30分钟2)离心管置于42绝缘90s冰浴2分钟4)每个管800ulLB液体培养基，在37 培养1小时(150r/min)(5)取适当体积(100毫升)的复苏细胞，涂在选择性培养基上，放入适量的30分钟(6)倒碟形37，1216h，群体出现3.3质粒提取阶段1)从LB培养基中提取1 4毫升，离心分离12000至1分钟，然后丢弃。(2)添加250ul溶液/rnasa(溶液I为细胞悬浮)混合液，漩涡会剧烈振动，室温保持1-2分钟，直到细菌完全重新升起为止。(。(3)加入250ul溶液(细胞分解液)，轻轻反复混合5-6次。在室温下放置1-2分钟，充分分解，直到形成干净的分解溶液为止。(4)加入350ul溶液(中和液)，直接轻轻反复搅拌5-6次，就会产生白色絮状物沉淀。5)12000室温下10分钟离心，收集上级。(6)将上等液放入DNA纯化栏，静置1-2分钟。7)12000离心1分钟，放弃滤液。(8)添加500ul溶液PB(清洁液)12000离心1分钟，以获得高性能质粒DNA，溶解硅胶膜上吸附的蛋白质、盐等杂质的滤液。9) 500ul溶液w(脱盐液)，12000旋转离心1分钟，滤液扔掉重复一次。(10)转动12000离心力3min，完全去除精炼柱上残留的液体。(11)将DNA精炼柱放进新的离心管，在悬浮液滴中放入50-100ul溶液Eluent(灭菌状态下的双蒸气水，PH 8.0-8.5)，在室温下放入2分钟。12)12000离心力1分钟。此时管底是在-20 保存的纯度高的质粒DNA。质粒提取阶段：1.5毫升离心管中12000旋转离心1分钟，清除，萃取培养基重复离心，将少量细菌作为菌种保存，直接放置在-20 250 ul buffes 1悬浮细菌中，悬浮均匀 250ulBufferS1 2轻柔混合4-6次再次重复，将制造管旋转到2ml离心管12000，将制造管移动到1分的离心力，将制造管移动到新1.5ml离心管，添加6080ulEluent或离子水，将制造管从室温1min12000移除到1分3354的离心力，将含有质粒的离心管保留在4 或-20 4、质粒DNA和其他包装质粒共产生293T细胞转染病毒(即病毒包装)4.1名词解释4.1.1293T细胞衍生自293细胞，表达SV40大t抗原的人肾上皮细胞株，瞬间转染，广泛用于多种目标蛋白过度表达或包装病毒。4.1.2脂质体：特定细胞质中的天然脂质载体，可作为生物膜，捕获外来物质后，更有效地将其输送到目标细胞，与细胞融合释放。4.2共同转染程序第一天：没有抗生素的DMEM 10版293FT细胞，2ml/孔。第二天细胞密度达到80%-90%的融合度第二天：1.500ul无血清培养基稀释2ug表达质粒1.5ug psPAX2包装质粒1.5ug pMD2。g涂层质粒500 ul无血清培养基稀释15ul脂质体20003.5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，在室温下静置20min4.6在鸭版中吸出1ml无血清培养基，然后加入1ml质粒和脂质体混合物。5.6-10h后，取出含有DNA-脂质体复合物的培养基，用正常培养液DMED 10代替，从此开始计算时间。）第三天：1.24小时转染后用荧光显微镜观察，转染效率必须达到70%以上第四天：1.转染后48和72h分别收获含病毒的上等液。2.3000 rpm离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。3.12000离心浓缩细胞，化妆-80C储存。4.滴漏测量目的基因验证和测试报告发布。4.3病毒包装原理质粒DNA可以转录慢病毒基因物质(RNA)，但不能翻译慢病毒的外壳和蛋白质成分的载体质粒，甚至是目标基因和报告基因，psPAX2是能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物通过附着机制更容易通过细胞膜，pMD2。g是慢病毒的膜质粒，通过Lipofectamine2000，3质粒传给目标细胞基因组，宿主基因组在表达时与宿主基因一起转录的目的基因RNA和psPAX2，pMD2。翻译成g基因的蛋白质是用伦病毒组装的。在上述节目中提到的“第四天”收集病毒。第五天，该病毒感染了目标细胞，病毒进入细胞后，该遗传物质RNA逆转了DNA，将该基因整合到目标细胞基因组中，完成了转染过程。质粒DNA只能转录病毒RNA和表达目的基因，不能表达病毒的外壳和膜蛋白成分，因此不能像普通病毒一样对宿主细胞重复增殖，对宿主细胞无害，将目的基因高效地传递到目标细胞基因组。5、慢病毒感染细胞5.1流程图5.2感染阶段1)包装：消化中等大生器官的细胞，然后以1*105/L浓度接种在12块鸭瓣上过夜2)感染：取出孔板的70-80%，与新鲜培养液一起加入PBS浓度梯度稀释的病毒液体，均匀搅拌，放入培养箱内培养。(3) 24小时左右可交换的液体根据细胞状态，在48小时内可以看到荧光。5.3荧光显微镜工作过程打开日光灯(如果不在30分钟内关掉，会影响显微镜的寿命)，将细胞培养板放在装载台上，调节物镜和光圈。首先用自然光观察视野内的细胞，然后关闭光，打开荧光通道，观察荧光强度以确定感染率。在对照片采样之前，可以调整曝光时间，通过增加值和色度使荧光照片最佳化。(对于Leica)5.4注意事项1.病毒浓度要适中，太少则细胞感染也很少，但病毒浓度太大，对细胞有害。2.感染病毒时培养基数量少，保证病毒浓度，培养10小时左右，可以根据培养基颜色添加培养基。3.如果细胞感染的复数形式不明确，可以进行浓度梯度感染，计算细胞感染的复数形式。4.添加病毒后一般可以24小时左右交换，48小时内可以看到荧光，具体时间取决于细胞状态。6、感染后细胞检测方法6.1荧光初步检测有了荧光，病毒感染成功了，但无法确认目的基因是否整合到细胞中，这与进一步检测、荧光强度、病毒添加量有关。6.2RNA提取和RT-PCR检测6.2.1原理真核细胞DNA有很多非编码区，因此真核生物的DNA在转录到RNA后切割或结合，移除这些非编码区，形成真正的mRNA，表达真核生物的基因，表达该蛋白质，只能通过提取自己的mRNA和RT-PCR来决定6.2.2RNA提取步骤加1mlTrizol，吹到1.5ml无菌离心管；100ul氯仿剧烈振动30s混合，12000转15分钟，明显分层；将上部透明液体放入新的1.5毫升离心管，加入等量的异丙醇，10分钟，12000转离心10分钟，抛弃，1ml70%乙醇，12000转，离心10分钟，抛弃，空气干燥残留液体，最后使用DEPC-水溶解RNA，电泳6.2.3RT-PCR步骤：RNA可以通过反转录过程包含引物、模版和酶，在PCR分析器的温度设置下逆转为cDNA。PCR是cDNA在模版、引物、酶的作用下复制成双链DNA的。(