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分子生物学基础，第四章遗传信息转录DNA到RNA，第一节RNA转录概述，第一、RNA转录特征在DNA指导下RNA的合成称为转录。 RNA链的转录始于DNA模板的特定起点，终止于特定终点，该转录区称为转录单位。 转录单位可以是一个基因，也可以是多个基因。 基因转录是一个选择性过程，不同的基因可以根据细胞生长阶段和细胞内外条件的变化而转录。 转录开始主要由DNA分子上的启动子控制，控制结束的部位称为终结器。 典型的转录单位结构如图4-1所示。 第一节RNA转录概述，图4-1的典型转录单元结构，第一节RNA转录概述，第二、转录的基本过程无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都是模板识别、转录开始、启动子和转录扩张和结束(图4-2 )。 图4-2大肠杆菌DNA依赖RNA转录过程，第一节RNA转录概述，1 .模板识别模板识别阶段主要是指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用结合的过程。 转录开始前，启动子附近的DNA链分离形成转录泡，促进基质核苷酸与模板DNA的碱基对。 转录开始是RNA链上最初的磷酸二脂键的发生。 2 .转录开始转录从化学过程来看，单一核苷酸与开链启动子酶复合体结合构成新生RNA的5 末端，再以磷酸二酯键的形式与第二核苷酸结合，开始终止反应为因子的释放。 以往认为磷酸二酯键的形式是转录开始的结束，但实际上，仅在新生RNA链达到69核苷酸时才形成稳定的酶-DNA-RNA三元复合体，释放因子，转录进入拉伸期。 第一节RNA转录概要，3 .启动子转录开始后，直到形成9个核苷酸短链为止通过启动子的阶段，RNA聚合酶位于启动子区域，新生RNA链和DNA模板链的结合不充分，容易从DNA链脱落，重新开始转录。 RNA聚合酶合成9个以上的核苷酸，离开启动子区域后，转录进入正常拉伸阶段。 因此，通过启动子的时间表示启动子的强弱。 4 .转录延伸RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动，使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。 大肠杆菌RNA聚合酶的活性一般是每秒合成50-90个核苷酸。 随着RNA聚合酶的迁移，DNA双螺旋继续解开，露出新的单链DNA模板，新生RNA链的3个末端继续延伸，在解链区形成RNA-DNA杂化。 在解锁区后面，与DNA模板链成对的非模板链再次双螺旋。 5 .转录结束RNA链延伸到转录结束部位时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂化物分离，转录泡破坏，DNA恢复到双链状态，RNA聚合酶和RNA链从模板中释放出来，转录结束。 第一节RNA转录概要、三、RNA聚合酶1 .原核生物的RNA聚合酶大多与原核生物RNA聚合酶的组成相同(表4-1 )，大肠杆菌RNA聚合酶由2个亚基、1个亚基、1个亚基和1个亚基构成，称为核酶加入亚基后变成聚合酶(holoenzyme )，相对分子质量为4.65105 (图4-3 )。 第一节RNA转录概述，2 .真核生物的RNA聚合酶真核生物基因组大于原核生物，RNA聚合酶也很复杂。 其相对分子质量为5105左右，有814个亚基，含有Zn2。 利用-鹅膏对毒蕈碱(-amanitine )的抑制作用，可将真核生物RNA聚合酶分为3类(表4-2 )。 第二节启动子和转录的开始之一，启动子的基本结构启动子是位于结构基因5 末端上游区域的DNA序列，激活RNA聚合酶，与模板DNA正确结合，具有转录开始的特异性。基因的特异转录取决于酶和启动子能否有效地形成二元复合体，因此RNA聚合酶如何有效地发现和结合启动子是转录开始过程中首要解决的问题。 实验表明，对于许多启动子，与RNA聚合酶结合的速度比布朗运动中的随机碰撞至少高100倍。 第二节启动子和转录的开始，1 .原核生物的启动子结构原核生物的启动子序列按功能分为3部分(图4-4上)。 (1)开始部位：指在DNA分子上开始转录的作用部位，在该部位有与生成RNA链的最初的核苷酸互补的碱基，从前述内容可知，该碱基的编号为1。 (2)结合部位： DNA分子上与RNA聚合酶核酶结合的部位，其长度为7bp，中心部位为10bp，碱基序列具有较高的保守性，富含TATAAT序列，故又称TATAbox，又称普利布诺序列(pribnowbox )。 该链段序列中AT碱丰富，维持双链键的氢键相对较弱，因此双链DNA容易解链，有利于RNA聚合酶的结合。 (3)识别部位：利用诱变技术可使启动子发生变异，表明-35序列发生变异时，RNA聚合酶与启动子的结合速度降低。 -35序列提供RNA聚合酶的识别信号，其序列碱基富含TTGACA，其中心正好位于-35bp，是RNA聚合酶亚单元的识别位点。 第二节启动子和转录的开始，图4-4原核和真核生物的启动子结构，第二节启动子和转录的开始，2 .真核生物的启动子结构科学家通过分析多个基因启动子区域，发现大部分功能蛋白基因的启动有共同的结构模式。 简而言之，真核基因的启动子(图4-4下)在-25-35区包括TATA序列，在-70-80区包括CCAAT序列(CAATbox )，在-80-110区包括GCCACACCC或GGGCGGG序列(GCbox )。 习惯上将TATA区上游的维护序列称为上游启动子元件(upsreamoterelement，UPE )或上游激活序列(upsreammatitingsequence，UAS )。 第二节启动子与转录的开始，3 .真核生物启动子对转录的影响TATA区与其他两个UPE区的作用不同(图4-5 )。 前者的主要作用是正确开始转录，如果除去TATA区或进行碱基突变，则转录产物的相对值与CAAT区或GC区的突变后相比并不明显，但得到的RNA产物的起点没有固定。 研究SV40晚期基因启动子是否发现存在上游活性区，对该启动子的生物活性有根本影响。 切除该基因5上游2147核苷酸序列，基因完全不表达(图46 )。 第二节启动子和转录开始，图4-5启动子区域主要顺式作用元件和基因转录活性，第二节启动子和转录开始，图4-6SV40基因启动子上TATAAA及附近区域对基因转录活性的影响，第二节启动子和转录开始2， 转录开始1 .启动子区域识别2 .原核生物转录开始原核生物转录的开始过程(图4-7):RNA聚合酶被诱导至亚基，被启动子识别并结合，DNA的局部双链被解除，形成的解链区域称为转录泡(transcriptionbubble )，链RNA聚合酶催化亚基通过模板链碱基的选择特异性识别底物核苷酸，形成磷酸二酯键脱离焦磷酸，合成RNA链的前29nt。 最初的核苷酸通常是具有3个磷酸基的鸟苷或腺苷(pppG或pppA )。 开始合成后，子单元脱离核酶和启动子，开始阶段到此结束。 第二节启动子和转录的开始，图4-7原核生物基因转录的开始，第二节启动子和转录的开始，3 .真核生物转录的开始除了RNA聚合酶外，真核生物转录的开始过程还必须涉及至少7种辅助蛋白质因子(表4-3 )。 由于许多辅助因子本身含有多个亚基，因此转录起始复合体的分子量特别大。真核生物转录开始过程(图4-8):7种辅助因子参与，RNA聚合酶与启动子相互作用，聚合酶首先与启动子区域的封闭双链DNA结合，形成双链封闭复合体，然后解链得到双链开放复合体。 解锁区一般介于9-13之间，酶与启动子结合的主要区域位于其上游。 开锁区解锁后，酶分子与解锁后的相关单链正确相互作用，形成开锁复合体。 因此，RNA聚合酶是双链DNA结合蛋白，也是单链DNA结合蛋白。 DNA开链是按照DNA模板序列正确导入核苷酸基质的必要条件。 第二节启动子和转录的开始，第二节启动子和转录的开始，图4-8真核生物RNA聚合酶指导的基因转录的开始，第二节启动子和转录的开始，三、增强子及其功能除启动子外，近年来还有一个序列转录的开始在SV40的转印单元中，在其转印开始部位的上游约200bp发现了不是启动子的一部分的2个72bp长度的重复序列，但是可以增强或促进转印开始，除去这2个序列，这些基因的转印水平大幅度降低，留下其中一个因此，将强化该转印开始的排列称为增强子或增强子。 除SV40外，逆转录病毒基因、免疫球蛋白基因、胰岛素基因、胰蛋白酶基因等多种基因启动子区陆续发现有增强子存在。 第三节转录的结束，一、不依赖因子的结束，表明模板DNA上存在结束转录的特殊信号的结束子，每个基因和操作子都有启动子和结束子。 终止部位上游一般存在富含GC碱基的双重对称区，该DNA转录产生的RNA容易形成卡发行结构。 终止部位之前有48个a组成的序列，因此转印生成物的3 端为低聚u这一结构特征的存在决定了转印的终止。 新生RNA出现发夹式结构会导致RNA聚合酶暂停，破坏RNA-DNA杂交链5 端的正常结构。 RNA3末端寡核u的存在使杂链的3末端部分不稳定的rUdA区域。 两者合作使RNA从三元复合体中解离(图4-9 )。 终止效率与双对称序列和少u的长度有关，并且随着卡发行结构(至少6bp )和少u序列(至少4u )的长度的增加，终止效率逐渐提高。 在第三节转录终止、第二、因子相关终止体外转录实验中，纯化的RNA聚合酶无法识别特异性转录终止信号，但加入大肠杆菌因子后，该聚合酶可在DNA模板上正确终止转录。 因子是相对分子质量为2.0105的六聚体蛋白，可水解各种核苷三磷酸，实际上是NTP酶，通过催化NTP的水解，新生RNA链从三元转录复合体中解离，中止转录。 依赖于因子的转录终止区的DNA序列没有共性，这表明这些终止部位不能识别。 现在，RNA合成开始后的因子附着在新生RNA链上，通过水解ATP产生的能量在53 方向上向RNA聚合酶移动，到达RNA的3oh末端后，取代停止在终止部位的RNA聚合酶，从模板DNA释放mRNA，转录过程。 第三节转录的终止，图4-11依赖于蛋白质因子的转录抗终止模式，在第四节转录后加工，另一方面，mRNA的加工1.5-末端帽结构在目前已知的5-末端帽结构在核内完成，在mRNA向中段序列的剪切过程之前，帽的作用部位为转录后的mrna5-末端帽结构如上所述，rn5-末端的最初核苷酸多见于嘌呤类，特别是以pppG为主，其作用过程通过磷酸酶水解5-pppG生成5-pg，再与另一个磷酸三氰基pppG反应，磷酸二氰基酯接着，通过甲基化酶的作用从SAM提供甲基，使甲基与后续的鸟嘌呤碱基N7位结合，生成5m7gppgp的结构被称为帽子结构(图4-12 )。 第四节转录后加工，图4-12真核生物mrna5-末端帽结构，第四节转录后加工，2.3-末端加尾真核生物成熟mrna3-末端通常有100200个腺苷酸残基，构成聚腺苷酸(polyA )的尾部。 由于DNA序列中没有聚t的序列，3尾polyA在转录后被附加。 研究表明，该序列AAUAAA是多腺苷酸化的信号，因为切除了保守序列，3 端不能切除，polyA尾巴也不能形成。 3 末端polyA尾的形成如图4-13所示。 第四节转录后加工，图4-13真核生物mrna3-末端polyA尾结构的形成，第四节转录后加工，3.mRNA中段序列的剪切真核生物细胞含有转录模板链中结构基因表达活性的碱基序列，称外显子，也有表达活性的碱基序列，称内含子，后者远多于前者转录生成的hnRNA有内含子序列和外显子序列。 切割是在戴帽子后进行的，用内核酸酶水解内含子和外显子的连接部位的磷酸二酯键，去除内含子，连接外显子生成成熟的mRNA (图4-14 )。 之后，mRNA通过核膜孔输送到细胞质，指导蛋白质的合成。 剪切过程比较复杂，其内含子通常左端为GU，右端为AG，这种结构形式不适用于线粒体和叶绿体的内含子，也不适用于tRNA和rRNA的编码基因，这种结构可能是内核酸酶的作用部位。 体外实验表明，切开首先在内含子左端GU外进行，一系列反应过程在内含子右端AG切开(图4-15 )。 第四节转录后加工，图4-14卵白蛋白mRNA剪切加工过程17:外显子； AG:内含子。 第四节转录后加工，图4-15前体mRNA中内含子的切断部位，第四节转录后加工，第二、tRNA加工1 .原核生物tRNA的加工(1)核酸内切酶与DNA限制内切酶不同，不能识别特异的序列，识别加工部位的空间结构。 (2)核酸外切酶从3 端各切除一个附加序列。 (3) 3末端CCAoh结构成熟tRNA的3末端有CCAoh结构。 (4)修饰碱的形成成熟的tRNA含有甲基化碱、二氢尿嘧啶等多种稀有碱。 它们是由特异性高的tRNA修饰酶作用形成的。 第四节转录后加工，图4-16tRNA前体加工，第四节转录后加工，2 .真核生物tRNA加工真核生物tRNA基因数多于原核生物tRNA基因数，但其基因也呈簇序列，相互隔离。 tRNA前体由RNA聚合酶转录合成，前体加工成熟的tRNA需要在核酸内核酸酶和内核酸酶的作用下切除5和3端的附加序列。 真核生物trna3端不含CCA-OH结构。 成熟tRNA也需要碱修饰，修饰反应的形式为甲基化反