实验一--大肠杆菌基因组提取

在实验开始，首先对实验的一些必须步骤（注：在几乎每一次小实验都会使用到的试验方法）做一定的解释。避免在写实验报告的过程中太过混乱！并且这些过程并不是每一位同学都参与了的，故在本实验报告的开篇写出。（一）制备1%的琼脂糖凝胶称取1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100 mL的1 TAE缓冲液，在微波炉中加热。完全融化后，取出摇匀。（二）胶板的制备1. 用橡皮膏将胶板的两端边缘封闭好。2. 将胶板放在水平处，放好样品梳子。 3. 将冷却到60左右的琼脂糖凝胶缓慢倒入胶板中，注意不要产生气泡。胶的厚度在3-5mm之间。4. 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放入电泳槽内（注意：梳子的方向靠近负极）。5. 向电泳槽中加入1 TAE缓冲液，缓冲液要浸没凝胶。（三）加样1. 在样品中加入适量的10 上样缓冲液，使缓冲液的终浓度为1。 2. 用微量移液器将已加入缓冲液的样品加入上样孔中。记录加样的顺序和加样量。（注意：加样的过程中不要让样品溢出上样孔）（四）电泳 1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意DNA片段是从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比。最高电压不超过5V/cm。2. 当溴酚蓝染料移动到凝胶的2/3处时，停止电泳。（五）染色将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中（带手套操作）。（六）观察实验结果在紫外灯（360 nm或254 nm）下观察染色后的凝胶，DNA处显出橘红色的荧光条带。实验一 大肠杆菌基因组提取【实验目的】1.学习并掌握细菌基因组的提取方法【实验原理】DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。【实验材料】 大肠杆菌DH5菌液【实验试剂】 LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇【实验仪器与用具】 微量移液器，低温离心机，水浴锅，eppendorf管，恒温摇床【实验步骤】 （1）将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5菌液5000rpm冷冻离心10min弃上清； （2）加190L TE悬浮沉淀，并加10L 10%SDS，1L 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37保温1h； （3）加30L 5mol/L NaCl，混匀； （4）加30L CTAB/NaCl溶液，混匀，65保温20min； （5）加入300L酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm离心10min，将上清液移至干净离心管； （6）加入300L氯仿/异戊醇（24：1）抽提，取上清液移至干净管中； （7）加300L异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA； （8）5000rpm离心10min，沉淀DNA，加入500L70%乙醇，5000rpm离心10min，弃乙醇，吸干； （9）溶解于20LTE，取3L 用于琼脂糖凝胶电泳验证，其余-20保存。【实验结果与分析】10 9 8 7 6 M如图所示，8号为本组实验结果。对比maker,第一条带为正常大肠杆菌基因组，中间可以看见模糊的两条带，可能为断裂的基因组片段，下面最亮的为RNA。出现断裂的基因组可能是由于操作过于剧烈。本组电泳带还比较清晰整齐，其他组不整齐的带可能是电泳技术问题。RNA含量很大，所以出现拖尾现象。实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备及验证【实验目的】 1.掌握感受态的制备和转化的原理 2.学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法 3.为重组子的转化做准备【实验原理】本实验采用CaCl2制备大肠杆菌的感受态细胞。所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70保存。在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法）。其原理是细菌处于0，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。【实验材料】 大肠杆菌DH5【实验试剂】 LB液体培养基，0.1mol/Lcacl2溶液【实验器材】 恒温摇床，超净工作台，高压灭菌锅，低温离心机，微量移液器【实验步骤】 一、感受态细胞的制备 1.将冻存的菌种1：100接种于3ml的LB液体培养基中，37摇床过夜震荡培养。 2.取1ml活化菌种接种于100mlLB培养基中，37摇床培养1.5-2h。 3.将菌种在冰上放置10min。4、4000rpm下离心10min收集菌体。 4.弃上清，用事先冰浴的0.1mol/Lcacl2重新悬浮细胞，冰浴30min。 5.收集菌体，条件同上。 6.弃上清，在冰浴条件下加入0.1mol/Lcacl2溶液。 7.分装保存（40%甘油与感受态细胞1：1混合，使甘油的终浓度为20%）。 二、验证 （一）制备含Amp的蓝白斑筛选琼脂平板 1.LB固体培养基融化后，待冷却到60 左右，加入氨苄青霉素（工作浓度为100 g/mL），混匀，倒入培养皿中。 2.培养基凝固后，在琼脂平板上加入40L的20 mg/mL的X-Gal和4L的200 mg/mLIPTG溶液，用涂布器涂匀。避光保存3h，以利于IPTG和X-Gal 的吸收。 （二）重组子的转化 1. 取200 L甘油保存的感受态细胞，低温融化后，加入1L的重组质粒（DNA 50ng），混匀，冰上放置30 min。同时做两个对照：（1）阴性对照： 200 L感受态细胞，不加任何质粒DNA。（2）阳性对照： 200 L感受态细胞，加入不带外源DNA的空载体。 2. 将转化的混合物立即放入42 循环水浴中90sec（注意：不要晃动）。 3. 然后冰浴2 min。 4. 在转化子中加入600L不含Amp的LB液体培养基，37 摇床培养1h（慢摇）。 5. 4000 rpm离心5 min，沉淀细菌细胞。 6. 用微量移液器去除上清溶液600 L。7. 将沉淀与剩余的上清混匀，涂在制备好的含Amp的琼脂平板上。阴性对照的转化混合物，一部分涂于含Amp的琼脂平板，一部分涂于不含Amp的琼脂平板上，以检测感受态细胞是否污染。 8. 待菌液完全被吸收后，37 倒置培养12-16 h。【实验结果与分析】实验结果： 感受态细胞制备成功，而且转化效率比较高。阴性对照没有出现菌落，结果正常。分析以及讨论： 感受态细胞转化效率的影响因素 （1）细胞的生长状态和密度最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为 05时，细胞密度在5107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 （2）质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。 （3）试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4。 （4）防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。 （5）整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。实验三 重组子的制备和转化【实验目的】 1.掌握PCR，回收与连接的原理 2.掌握重组质粒制备的方法【实验原理】（一） PCR原理 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外DNA扩增技术。该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段DNA扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点。PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3端开始按53方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性复性延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，假设PCR的效率为100%,反复n周期后，理论上就能扩增2n倍。PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95，复性温度为3755，延伸合成温度为72，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95左右的高温而不失活），反应循环数为30。如图：（二）DNA重组技术 重组DNA(RecombinantDNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤： 1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。 【实验器材】PCR扩增仪，台式高速离心机，移液器，经高压灭菌后的Eppendorf管，电泳仪，回收试剂盒。【实验试剂】 （1）模板DNA（0.1g/l）：用牙签挑取单菌落悬浮到50l的裂解液中（裂解液1%TritonX-100，20mmol/l Tris-HCl PH 8.2, 2mmol/l EDTA）, 95温浴10分钟, 10000rpm离心5分钟,取2l上清液用于总体积50l的PCR反应。（2）TaqDNA聚合酶（5U/l），10扩增缓冲液，dNTP（1mmol/L）：购买（3）引物（100pmol/L）：设计并合成与目的DNA两侧互补的引物内。（4）回收试剂（5）T4 DNA连接酶（6）10 连接反应缓冲液 （6）50% PEG4000 【实验步骤】一、PCR技术体外扩增DNA片段 1. 在已灭菌的0.5 mL的离心管中配制PCR反应的25 L反应体系。依次加入下列试剂： Premix溶液 12.5 L 引物1 1L引物2 1L模板DNA 1uL双蒸水 9.5L 2. PCR反应条件94 1min 94 30sec 50 1min 72 3min 72 5min 4保存, 从第二步至第四步30个循环。 3. 2%琼脂糖凝胶电泳检测和分析PCR结果。二、DNA片段的回收 在本实验中，目的DNA片段的回收采用的是北京鼎国生物DNA回收/纯化试剂盒 溶液A 100mL 6mol/L NaClO4，0.03mol/L NaAc（pH5.2），少量酚红溶液B 1.5mL 3mol/L NaAc溶液C 60mL用时需要加入70mL无水乙醇，充分混匀溶液D 6mL TE缓冲液DNA片段回收方法 （1）切取含DNA片段的琼脂糖（100mg-300mg），以1：3（切取重量与溶液的A体积比）加入溶液A； （2）50-65水浴5-10min，待凝胶全部溶化，其间振荡助溶2-3次，加入15L溶液B，充分混匀；（3）将溶液置于离心柱中，静止2min，10000rpm离心30s；若一次加不完，可分两次离心；（4）倒掉液体，加500L溶液C于离心柱中，10000rpm离离心30s，弃液体。 （5）重复步骤（4）一次； （6）12000rpm离心1min，甩干剩余液体，除去残余的酒精； （7）将离心柱放置于新的离心管中，室温敞开离心管盖，放置10min，使乙醇挥发殆尽； （8）加入20L溶液D（50水浴），静止2min； （9）15000rpm离心1min，管底溶液即为所需的DNA； （10）将DNA储存于贮存于-20冰箱中。三、DNA的重组 在0.5 mL的已灭菌的离心管中依次加入下列溶液T4 DNA连接酶 1 L10 连接反应缓冲液 2 LPUCm-T 载体 9 L 纯化后的PCR产物 8 L16连接过夜。上面载体及目的片段量是根据本组实验结果确定的，在实际操作中要根据具体情况而定，若体系不足20L则用无菌水补足至10L。【实验结果】PCR回收结果 10 9 8 7 6 M 5 4 3 2 18号泳道为本组实验结果，相对于PCR结果来讲，回收效率不是很高，可能原因分析如下： 1.切胶时胶块体积太大，溶胶效果不好 2.DNA吸附后洗脱不完全3.操作过程中的损失实验四 重组子转化及筛选【实验目的】 掌握DNA重组技术的基本原理和基本方法【实验原理】1、将重组DNA分子转化宿主细胞。 2、克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。 4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。3、蓝白斑筛选：IPTG可诱导lacZ形成肽链,该产物能与有缺陷的宿主细胞所编码的N-末端发生基因内互补，形成有活性的-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈现蓝色。当外源基因DNA片段插入多克隆位点后, 使其编码的肽链失去活性, 使其不能形成-互补, 因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。 【实验步骤】 （1）取200 L甘油保存的感受态细胞，低温融化后，加入重组质粒，混匀，冰上放置30 min；（2） 将转化的混合物立即放入42 循环水浴中90sec（注意：不要晃动）；（3） 然后冰浴2 min；（4） 在转化子中加入600L不含Amp的LB液体培养基，37 摇床培养1h（慢摇）；（5） 4000 rpm离心5 min，沉淀细菌细胞；（6） 用微量移液器去除上清溶液600 L； （7）将沉淀与剩余的上清混匀，涂在制备好的琼脂平板上；（8） 待菌液完全被吸收后，37 倒置培养。【实验结果及分析】用所制备的感受态，对连接所制备的重组子进行转化，观察转化结果，结果正确。其中，阳性菌落即白色菌落。原因是根据蓝白斑筛选的原理，当外源基因DNA片段插入多克隆位点后, 使其编码的肽链失去活性, 使其不能形成-互补, 因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。而我们所构建的重组子即由我们的目的片段插入到载体的多克隆位点，使不能形成-互补，则使菌落呈白色。实验五 菌种保存及质粒DNA的小量提取酶切验证【实验目的】 1.掌握菌种保存的方法 2.掌握质粒DNA小量提取的原理及方法 3.酶切验证重组子的转化是否正确【实验原理】 实验采用-70保存菌种，使菌种的代谢处于最低状态。碱裂解法提取质粒的原理是在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质等等。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层、变性蛋白层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，获得质粒DNA。小提质粒所用溶液配方：1. 溶液50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L Tris HCl（三羟甲基氨基甲烷）pH 8.010 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸） pH8.02. 溶液0.4 mol/L NaOH2% SDS用前等体积混合3. 溶液5 mol/L乙酸钾 60 mL冰乙酸 11.5 mL水 28.5 mL【实验材料】 大肠杆菌DH5菌液，RNA酶【实验试剂】 LB液体、固体培养基，40%甘油，小提质粒裂解液、，酚氯仿，无水乙醇，70%乙醇【实验仪器与用具】 微量移液器，培养皿，试管，恒温摇床，冻存管，低温离心机，