原位杂交操作流程PPT课件

.,1,原位杂交操作流程,.,2,冰冻切片的（DIG-labeledRNAprobe）原位杂交操作程序一、切片制备用新鲜组织制作6m厚冰冻切片，37干燥14小时，进行下一步操作。二、预杂交前处理预固定：4%PFA（inDEPC-PBSPh7.4）RT3060min4%PFA：多聚甲醛20g1PBS450ml加热（60、20min）溶解冷却后调pH至7.41PBS500mlPBSRT5min210PBS：500mlNaCl40gKCl1gKH2PO41gNa2HPO47.7gDEPC水450ml调Ph至7.5DEPC水加至500mlPBS(含0.3%v/vTritonX-100)RT15min临用前配制10%TritonX-10015ml1PBS500mlPBSRT5min2,.,3,消化：2g/mlProteinaseKinTEbuffer3710minTE：pH8.0Tris-HCl1M5mlpH8.0EDTA0.5M1mlDEPC水500ml0.2%GlycininPBSRT5min2(50 xDenharts;Ficoll400聚蔗糖1g后固定：4%PFAinPBSRT15minPVP聚乙烯基吡咯烷酮1gBSA牛血清白蛋白1gDEPC水100ml）PBSRT3min20.1M三乙醇胺（TEA）/0.25%乙酸酐RT5min20.1M三乙醇胺：三乙醇胺2.64mlDEPC水200ml用前加入乙酸酐500lPBSRT5min2,.,4,三、预杂交预杂交502h预杂交液：50%去离子甲酰胺5SSC5Denhardts0.02%SDS0.1mg/mltRNA四、杂交杂交5012h以上,.,5,五、杂交后处理2SSC脱去盖膜（片）502SSC清洗3710min220g/mlRNaseAinRnsaebuffer3730minRnsaebuffer;2MTris5ml0.25MEDTA4ml3MnaCl167mlpH8.0DW1000mlRnasebuffer3730min2SSC5015min21SSC（含0.02%SDS）3715min25%SDS2ml1SSC500ml0.1SSC3715min2,.,6,Buffer3710min2Buffer:2MTris-HClPh7.625ml3MNaCl25mlD.W.500ml封闭；0.5%抗体阻断液inBuffer（含0.2%Tween20）3720min抗体阻断液:(1:500抗地高辛抗体in阻断液372h)阻断剂1gTween-200.4mlBuffer3710min2Buffer200mlBuffer3710min2,.,7,显色；Buffer:2MTris10ml（1:50NBT/BCIPStockSolutioninBuffer224h）3MNaCl6.67mlMgCl22.033g（湿合、避光）D.W.180ml浓HCl调pH至9.5D.W.200ml终止反应：BufferRT5min2流水冲洗5-10min1%甲基绿复染3-10min，水洗，晾干，封固,.,8,DNA探针检测石蜡切片中DNA,.,9,组织标本,肝穿刺组织，常规石蜡包埋，4m连续石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的干净载玻片上，58烤18h。,.,10,试剂,120SSC2HBVcDNA-Dig探针5g34多聚甲醛40.1mol/LPBS，pH7.450.2mmol/LHCl和0.1mol/L甘氨酸PBSpH7.460.4TritorX-100PBSpH7.47蛋白酶20g/ml80.25乙酸酐，用0.1mol/L三乙醇胺配制9预杂交缓冲液和杂交缓冲液10.AKP标记抗DigFab段二抗，可1:500稀释11.TSM、TSM2（配制参阅附录4）12.NBT和BCIP显色液或用AKP显色Kit,.,11,操作流程,杂交前处理预杂交杂交杂交后漂洗杂交后检测结果判断,.,12,杂交前处理,1.石蜡切片常规脱蜡至水2.0.02MpH7.4PBS洗33min3.0.2MHCI20min室温（除去蛋白）4.2SSC（内含5MEDTA）50洗30min5.蛋白酶2g/ml3720min6.0.1M甘氨酸PBS洗10min室温，中止酶反应7.4多聚甲醛，20min室温8.PBS洗33min9.75，85，95和无水乙醇各2min,.,13,预杂交和杂交,加预杂交液20l/每片，422h。加杂交液1020ul/每片（内含HBV-cDNADig标记探针4g/ml），加盖硅化玻片，将切片置于9510min，使探针和靶病毒DNA双链打开（变性），然后迅速置于冰上5min，再将切片置于盛有2SSC湿合内，42杂交过夜(1216h)。,.,14,杂交后漂洗,1.将切片置于2SSC液内振动移去盖片2.2SSC洗210min，553.0.5SSC25min，504.PBS洗33min5.10醋酸20min室温，阻断内源性碱性磷酸酶6.PBS洗33min,.,15,信号放大和显示,1.1:500稀释AKP标记抗Dig二抗，374h，或4过夜2.PBS洗33min3.TSM1洗25min4.TSM2洗25min5.显色液在1mlTSM2中加入4.5lNBT，3.5l，BCIP混合后，显色30min12h，中间不断观察6.TSM2洗，PBS洗33min，核固红或甲基绿衬染7.蒸镏水洗，系列乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片,.,16,结果判断,.,17,ISH流程,探针合成组织细胞标本的准备ISH试剂的配制操作流程,.,18,探针,1、根据文献报道合成PCR引物一对。2、PCR扩增：用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。,.,19,3、将PCR扩增产物亚克隆入pGEM2Z质粒（EcoRI和ACCI酶切位点），在大肠杆菌中扩增，纯化。原理：PGEM3质粒购于promega公司，含有位于pUc19MCS侧面的SP6和T7RNA聚合酶启动子，在将所需序列插入MCS后，一个简单的基于lacZ-肽灭活的颜色选择方案将促进重组体的筛选。在体外，将SP6或T7RNA聚合酶加入到含有标记物的三磷酸核苷前体的转录系统中，可允许从任何一方向产生多拷贝DNA插入序列的标记RNA探针。,.,20,4、利用Roche生产的体外转录标记RNAkit（Cat.No999644）操作流程参阅原位检测技术p132-133。,.,21,组织细胞标本的准备ISH试剂的配制（所有试剂和用具均用DEPC水处理）,.,22,操作流程,11、活细胞经4多聚甲醛固定20min，室温，PBS洗，系列乙醇脱水。2、组织标本：标准取材后，4多聚甲醛固定6h，用25遮糖或液氮速冻，切片贴在涂有APES胶的干净载玻片上。3、PBS洗33min，冰冻切用4%柠檬酸盐90保温20min，石蜡切片9810min，细胞片不用。4、2g/ml蛋白酶K3720min，PBS洗33min。5、0.1mol/L甘氨酸PBS洗10min.6、0.25%乙酸酐的0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)洗10min，PBS洗10min。,.,23,7、预杂交0.2SSC50甲酰胺30min37。8、杂交：滴加杂交液（2g/ml）加一层复盖膜，48杂交8-12h。9、杂交后洗：2SSC洗25min451SSC洗25min室温0.5SSC洗25min室温0.1SSC洗2