第七章 色普法.ppt

第7章色谱法,第三节色谱分析(Chromatography),固定相CaCO3颗粒流动相石油醚,1903年，俄国植物学家茨维特分离植物色素,优点：“三高”、“一快”、“一广”,高选择性可将性质相似的组分分开高效能反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果高灵敏度10-1110-13g，适于痕量分析分析速度快几几十分钟完成分离一次可以测多种样品应用范围广气体，液体、固体物质;无机物、有机物、生物大分子化合物；可分离定性、可定量及制备,色谱方法特点,色谱法CHROMATOGRAPHY,色谱法(层析技术)是一类物理分离方法,根据待分离混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中,由于各组分随流动相前进的速度不同,从而得到有效分离。,慢中等快,色谱分离,色谱法进行时有两个相，一个相称为固定相(Stationaryphase)，另一相称为流动相(Mobilephase)。由于各组分所受固定相的阻力和流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得到分离。,二、层析分离技术的分类,（一）依操作形式分分为纸层析、薄层层析和柱层析。,（二）依流动相分根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。,（三）依分离机理分1.吸附层析2.分配层析3.凝胶过滤4.离子交换层析5.亲和层析6.疏水层析,定义：纸色谱分离法又称纸层析法，是根据不同物质在两相中的分配比不同而进行分离的一种微量分离方法。,第一章纸色谱法,载体层析纸（滤纸）；固定相滤纸上的吸湿水分；流动相有机溶剂（展开剂）。,分离示意图,上行法,采用上行法时，流动相由于毛细管作用自下而上地移动，流动相上升时，与滤纸上的固定相相遇，这时试样中的各组分就在两相中不断进行分配。因为它们的分配比不同，分配比大的组分上升得快，分配比小的组分上升得慢，从而形成了距离原点不等的层析斑点，达到分离的目的。,RF:通常用比移值RF衡量各组分的分离程度：,RF:01。RF值相差越大，分离效果越好。,RF：物质定性分析的依据。在进行分析工作时，可使用各组分相应的标准样品同时作对照实验。,纸色谱的影响因素,1滤纸的影响2展开剂的影响3物质极性的影响4pH的影响5温度和时间的影响,双向纸色谱,纸色谱法分离和鉴定的氨基酸混合液：异亮氨酸、赖氨酸和谷氨酸氨基酸是无色的，在层析后需在纸上喷洒显色剂茚三酮，斑点呈现蓝紫色。显色机理：,（1）,举例,（2）,（3）,主要仪器：（1）玻璃层析筒150mm300mm(h)。（2）层析纸条100mm240mm。（3）毛细管直径1mm左右。（4）喷雾器,仪器试剂,主要试剂：（1）展开剂正丁醇:甲酸:水60:12:8。（2）氨基酸标准溶液2gL-1水溶液。（3）茚三酮1gL-1乙醇溶液。（4）氨基酸混合试液将（2）配制的三种氨基酸等量混合。,仪器试剂,步骤,点样,展开分离,显色,计算比移值,点样,各点2mm,展开分离,滤纸下端浸入展开剂约0.5cm，计时。,展开分离,晾干或烘干展开剂,显色,l00烘箱中，烘35min,计算RF,用铅笔描出各斑点的轮廓,（1）计算RF和RF。（2）定性分析。,数据处理,1.手应捏纸条顶端；2.毛细管不能混用；3.纸条应垂直悬挂在层析筒中，不能卷曲；4.应均匀喷洒显色剂，显色剂喷洒量应适当，不能流淌。,注意事项,第二节薄层色谱法(thinlayerchromatography；TLC),定义固定相（吸附剂或载体）涂布成一均匀薄层，点样，（密闭的容器中）展开，斑点显色，（与对照物质）比较进行定性定量。原理组分在薄层板上多次吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。通过吸附系数不等实现组分的分离。,特点：快，需十至几十分钟，同时展开多个试样。试样预处理简单，对试样限制少。载样量比较大，适用于制备。仪器简单，操作方便。分离能力较强。灵敏度较高。,缺点：重现性差：尤其是定量每步要严格操作色谱板不易保存,色谱法参数,定性参数相平衡参数分离参数,定性参数1,比移值(Rf值)溶质移动距离与流动相移动距离之比。（速度之比？）Rf=L/L0（定时展开）L为原点（origin）至斑点中心的距离，L0为原点至溶剂前沿（solventfront）的距离与组分及色谱条件有关,相平衡参数,分配系数K=Cs/Cm容量因子k=CsVs/CmVm衡量薄层板对于待测组分在色谱平衡状态是保留能力,分离参数,分离度（R）相邻两组分的分离效能,二吸附剂的选择,1.背材：支持吸附剂的材料。光滑平整耐腐蚀，常用玻璃板。预制板有：铝和塑料扫描用：长度为10、15、20，宽度10、20,2.吸附剂：（1）性质：活性即保留溶质组分的程度，有较大的吸附面积，普通板粒度为20微米，高效板为5微米（2）常用：硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺、葡萄糖凝胶（3）选择原则：样品组分的性质和吸附剂的性质,样品组分的性质,吸附剂的性质,根据薄层色谱的分离机制，选择适宜活性的吸附剂。吸附剂对样品的作用：薄层的显色方法不同，所用的吸附剂也不同。吸附剂的规格,3.展开剂：,(1)对展开剂的要求：够溶解待测组分；能使待测组分与杂质分开；使待测组分的Rf值在0.2-0.8之间；不能与待测组分或吸附剂发生化学反应；具有适中的沸点和比较小的粘度；展开后组分的斑点圆且集中；混合溶剂最好临用前新鲜配制（2）性质：极性、强度、选择性（3）选择：一元、二元、多元,展开剂(流动相),极性强的溶剂洗脱能力强常用溶剂的极性强弱顺序：水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳环己烷石油醚。,展开剂,混合溶剂先用单一溶剂展开，若Rf值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，如果Rf值太大，则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等)，以降低极性。可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。,TLC的基本操作方法,薄层色谱法常见的问题和消除的方法,(一)斑点拖尾现象(二)边缘效应(三)S形及波浪形斑点(四)斑点呈念珠状(五)展速慢(六)Rf值不稳定,在药物分析中的应用,1.定性鉴别2.药品质量控制和杂质检查3.化学反应进程的控制,反应副产物的检出以及