生物工程下游技术4.沉淀法

沉淀法Precipitation,第四章,沉淀法概述,沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。,生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。,沉淀和结晶的区别:形态成分纯度操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。,沉淀法操作步骤：加入沉淀剂。沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。,沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取。优点：设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产；缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度常比结晶法低，过滤也较困难。,eg.从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白和96%99%的白蛋白。,图1利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图,沉淀法分离蛋白质的特点：生产前期可使原料液体体积很快减小1050倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；使中间产物保持在一个中性温和的环境；可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。,蛋白质的溶解特性,蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。,图2蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域,表1影响蛋白质溶解度的参数,蛋白质胶体溶液的稳定性,防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：,蛋白质周围的水化层（hydrationshell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。,蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。,蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。,图3,吸引力,颗粒间的相互作用颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。VanderWaals力Keeson引力（偶极力）Debye引力（诱导力）London引力（色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。,DLVO理论,颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现为吸引位能。虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该理论对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮助，同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。,其他沉淀法,金属沉淀法,聚电解质沉淀法,非离子型聚合物沉淀法,蛋白质沉淀方法,有机溶剂盐析法,等电点沉淀法,中性盐盐析法,中性盐盐析过程,当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象低盐浓度下，蛋白质溶解度增大。（2）“盐析”现象高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降。,中性盐盐析法,图4中性盐盐析法机理示意图,离子强度对盐析过程的影响,Cohn经验公式S蛋白质溶解度，mol/L;I离子强度c:离子浓度；Z：离子化合价,，Ks常数,和Ks的物理意义,盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；Ks盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。,常数Ks代表图中直线的斜率；代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。,用盐析法分离蛋白质的二种方法,在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为“s”分级盐析法。（Ks盐析：固定pH,温度，改变盐浓度）在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“”分级盐析法。（盐析：固定离子强度，改变pH及温度。）,其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。而盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。,盐析用盐的选择,在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱（Ks）磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁,选用盐析用盐的几点考虑,盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济,常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸铵在水中的溶解度很高但具腐蚀性，硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。,Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序，称Hofmeister序列，或感胶离子序。阴离子：柠檬酸根-3酒石酸根-3F-I03-H2P04-S04-CH3C00-Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS-；阳离子：Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+。,图5碳血红蛋白在不同盐溶液中的盐溶和盐析,影响盐析的因素,溶质种类的影响：Ks和值溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量通常调整体系pH值，使其在pI附近；盐析温度：一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降,左图表示对卵清蛋白和碳氧血红蛋白进行盐析时，随pH的变化。由于代表溶解度的对数，故变化一个单位，溶解度就变化10倍。通常在等电点附近有极小值。两种蛋白质的相对溶解度会随pH而变化很大；例如从图上可见，当pH从5变到6时，在一定盐浓度下，两种蛋白质溶解度之比的变化可达几千倍。,等电点沉淀法,蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。,（1）适用于疏水性强的蛋白质（2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。（3）无机酸通常价格便宜，无毒（4）蛋白质对低pH敏感，易失活,许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。,有机溶剂沉淀法,图7pH4.8时人白蛋白在乙醇-水溶液中的溶解度,加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。,机理分析进展,不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过试验加以选择。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。,有机溶剂沉析的特点,分辨率高；溶剂容易分离，并可回收使用；产品洁净；容易使蛋白质等生物大分子失活；应注意在低温下操作；成本高,运用有机溶剂沉淀蛋白质应注意的因素：温度；乙醇浓度；pH值；蛋白质浓度。,20世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，如：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。,非离子型聚合物沉淀法,图8蛋白质浓度对用PEG6000沉淀酵母醇脱氢酶时的影响,基于体积不相容性，即PEG分子从溶剂中空间排斥蛋白质，优先水合作用的程度取决于所用PEG的分子大小和浓度，排斥体积与PEG分子大小的平方根有关。,PEG沉淀作用的机理,体系的温度只需控制在室温条件下；沉淀的颗粒较大，产物易收集；PEG非但不会使大多数蛋白质变性，且可提高其稳定性。,优点,缺点,PEG难从蛋白质溶液中除去。,聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物，可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。,沉淀机理,能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；,金属沉淀法,沉淀机理,金属离子能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。,金属离子沉淀蛋白质可分为三类：,能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；与巯基化合物强烈结合的金属离子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。实际使用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L。,Zn2+沉淀尿激酶,近来，对于金属离子沉淀蛋白质的概念有所扩大，开始使用金属的螯合物来进行沉淀，如：用锌的螯合物与基因工程的聚组胺酸肽段相结合，从而使蛋白质沉淀。,其它沉淀方法1.亲和沉淀,亲和沉淀是利用蛋白质与特定的生物的或合成的分子(免疫配位体、基质、辅酶等)之间高度专一性的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。该方法提供了一个从复杂混合物中分离提取出单一产品的有效方法。其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。,初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀；所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体中离解出来。,该技术的三个步骤：,表2亲和沉淀纯化蛋白质的实例,2.选择性变性沉淀法,选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为选择性变性沉淀法。,（1）例如对于-淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。（2）根据欲分离物质所含杂质的特性，通过改变pH值或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而被除去。,3.选择性溶剂沉淀法,核酸的沉淀分离，可以选择适宜的溶剂进行处理，使蛋白质等杂质变性沉淀而获得核酸，这种方法又称为选择性溶剂沉淀法。,（1）在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。（2）在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在的条件下，用苯酚-水溶液提取核酸，DNA、RNA存在于水溶液中，而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去；（3）在DNA、RNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA，而RNA留在溶液中。,说明,选择沉淀方法时，应从以下几方面综合考虑：沉淀剂是否会引起蛋白质分子破坏；沉淀剂本身的性质；沉淀操作的成本、难易程度；残留沉淀剂的去除难度，最终产品的产率及纯度的要求等。,沉淀法应用,利用蛋白质沉淀大规模提纯蛋白与免疫球蛋白的工艺柠檬酸的生产萃取一沉淀法提取分离茶多酚,标准沉淀法回收柠檬酸流程图,加热到70度,新工艺的主要种类,我国从上世纪60年代就开始研究非钙盐法的提取工艺，近三、五年取得了实质性突破。根据行业科技交流刊物的报道，已进行过中试或生产规模试验的技术有三类：（1）是中国科学院和阜阳柠檬酸厂合作的“工业离子色谱法（ILCS）法”（离色法）；（2）另一种是江南大学的“连续变温逆流色谱分离法”（色谱法）；（3）还有天津科技大学的“吸附交换分离法”（吸交法）。,沉淀法的一般工艺路线,