第一章-动物细胞工程兴起的时代背景和发展

动物细胞工程AnimalCellularEngineering,08-09-(二),王敏强烟台大学化学生物理工学院Emai:Wangmqytu,主要参考书,绪论细胞工程兴起的时代背景和发展,本章主要内容：0.1简介(概念、学科地位、研究内容与任务等)0.2动物细胞工程学的发展-基础（细胞培养、细胞融合、核移植、转基因）-主要技术0.3动物细胞工程实践应用发展趋势-医学-农牧渔业-环境保护-化工、能源,本章目录导航,在人类告别20世纪步入21世纪的近十年中，生命科学取得了一个又一个令人鼓舞的成就。在这些成就中，动物细胞工程所作出的贡献极为突出，特别是克隆动物、干细胞、生物反应器等。,从学科建设讲，细胞工程是生物工程的一个重要分支。传统意义上的“工程”-对自然物体进行人工改造，使自然物体更为有用。生物工程则是通过对有生命活力的有机物的人工改造,使其更有效地服务于人。,细胞工程,基因工程,酶工程,微生物工程,生物化学工程,生物工程技术,动物,植物,细胞工程的地位,细胞工程在生物工程中占有重要地位,从应用角度讲，细胞为各种基因的克隆、表达和产物的合成提供了基础和载体。微生物工程中工程菌的构建，酶工程、生化工程和蛋白质工程中蛋白质合成等，都离不开细胞工程。基因工程是现代生物技术的核心；细胞工程则是它的基础和公用平台，基因工程与细胞工程的结合决定着生物技术的发展。,-细胞水平上的生命活动是连接分子水平上的生物大分子和个体水平上的各种器官系统的综合生命活动的“桥梁”。围绕着生命活动这个中心:-分子水平:研究DNA的复制与转录、RNA的翻译、蛋白质执行各种生命活动；-个体水平：研究遗传和发育；-细胞水平：研究细胞增殖、分化、死亡。,细胞在生命活动层次,0.1动物细胞工程简介,0.1.1概念-应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论与技术，按照要求，有计划地、大规模地培养动物组织和细胞，以获得生物及其产品，或改变细胞的遗传组成以产生新的品种，为人类生活提供需要的技术-冯伯森（2001）。-是按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程-安利国（2005）。,0.1.2研究内容和任务,细胞培养与细胞融合:单克隆抗体，组织修复等。动物细胞生殖工程包括：动物胚胎移植（试管动物、显微受精、胚胎体外培养和移植技术所获得的各种动物）、克隆动物等。染色体工程：多倍体培育。转基因动物、乳腺生物反应器等。,(1)研究内容,-随着研究工作的深入及拓展，还产生出一些新内容：细胞融合与重组、性别控制（流式细胞仪）、种质资源保护利用、干细胞、乳腺生物反应器等。可见，动物细胞工程学与各相关学科相互依赖，互相借鉴，共同发展，是一门综合了多学科科知识发展起来的理论应用性学科。,研究任务：,-研究离体培养条件下，细胞或组织器官所需营养条件和环境条件；-细胞或组织器官的形态发生规律；-细胞融合机理、种质资源的离体保存和方法；-动物胚胎移植、胚胎体外生产、动物克隆等；-改良生物品种，创造新的生物种类，为人类造福。,0.2动物细胞工程学的发展,0.2.1细胞工程建立与发展的基础细胞是所有生命形式的基本单位。最简单的生命体是可以单独生活的单细胞生物如细菌。我们人体大约由75x1016个细胞组成。每一个细胞含有相同的遗传信息，由于基因的选择性表达，导致细胞的多样性。,细胞学说的创立,1839年，德国动物学家Schwann和Schleiden建立了细胞学。Schwann证实Schleiden提出的所有植物体都是由细胞构成的观点，提出所有动物也是由细胞构成的。施旺指出：“细胞是有机体，整个动物或植物体乃是细胞的集合体。它们依照一定的规律排列在动物体内”。,（1）细胞培养,细胞培养（Cellculture）：从机体中取出的细胞，在体外模拟体内的生理环境培养并使之生存和生长。历史回顾-19世纪：1839年，Schwann和Schleiden建立了细胞学。19世纪30年代，德国植物学家M.J.Schleiden（1938)发现所有植物体都是由细胞构成的，德国动物学家M.J.Schwann证实：“如同植物一样，所有动物也是由细胞构成的。“细胞是有机体，整个动物或植物体乃是细胞的集合体”。,此后细胞学研究飞速发展。Flamming（1882）在动物细胞中发现了有丝分裂。VanBenden（1883）和Strassburge（1886）分别在动物和植物细胞中发现了减数分裂。为细胞与组织培养技术的创立奠定了重要的实验基础。Hertwig（1876）和Strassburge（1884）分别在动物和植物中观察到了受精和精卵细胞融合现象。1885年，德国人WihelmRoux用温生理盐水培养鸡胚组织，使之存活了数月之久，公认为是进行组织(细胞)培养最早的学者之一。1887年，Arnold把桤木的木髓碎片接种到蛙身上，当白细胞侵入这些碎片后，把这些白细胞收集在盛有盐水的小碟子中，这些白细胞能运动，并存活了一段时间。,历史回顾-19世纪,组织培养技术最早由Harrison于1907年创立。当时他想通过神经组织的体外培养，弄清神经纤维的起源问题。他首次利用悬滴培养法（hanging-dropcultivation），在体外成功地培养出神经细胞，并观察到了神经纤维发生的动态过程；建立了无菌操作技术。,20世纪-动物组织培养技术发端,1910年，美国人Harrison和法国人Carrel创建了盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。建立了体外培养组织和细胞的基本模式。后来许多学者对培养容器、培养液（基）和操作技术进行了革新。在动物胚胎培养方面，Brachet(1913)最早对比利时兔囊胚进行体外培养。1951年，厄尔利（Earle）等人开发了供动物细胞体外培养的培养基，动物细胞培养技术开始形成。1957年，Whitten用加入牛血清白蛋白（BSA）的生理盐水和用乳酸盐配制的简单培养液，把2-细胞小鼠胚胎培养到囊胚阶段。,上世纪70年代后期，随着微生物基因工程技术的发展，人们希望能通过基因重组技术，生产一些与人类密切相关的药用活性蛋白，但遇到许多生物活性蛋白不能在原核生物细胞表达，而只能在真核生物-动物细胞中产生的问题。主要是原核细胞本身缺乏蛋白质转录后修饰能力。上世纪80年代以后，随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发展，人们能够把特定的外源基因通过PCR技术扩增几千倍，并可转染到其他动物细胞内，使其得到高质量的表达。,细胞融合（cellfusion）,真正意义上的细胞工程是从细胞融合开始的。细胞融合（也叫细胞杂交）：是指在离体条件下，用人工方法把不同种的细胞或同种生物不同类型的单细胞，通过无性方式融合成一个杂种细胞。历程：19世纪30年代,Mller,Schwann,Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞（也称合胞体）的现象。1875年，Lange观察到蛙的血细胞中有多核细胞。,此后人们又进一步开展了融合剂的研究,发现了仙台病毒、化学试剂聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）、电脉冲等均能诱导细胞融合，显微操作方法更直接的实现不同物种或同一物种的细胞融合。,图1-1动植物细胞融合过程比较图,细胞核移植,由德国胚胎学家Spemann于1938年最早提出。认为早期胚胎细胞具有高度分化潜力,胚胎的细胞核移植到去核卵母细胞中可发育为新胚胎。细胞核移植历程：1952年，BriggtKings将非州豹蛙囊胚细胞核移入到去核卵母细胞中获得了克隆后代。1962年，Gurden将南非爪蟾蝌蚪期肠上皮细胞核移植到被紫外线破坏了细胞核的卵母细胞内，得到发育正常的个体。,哺乳动物胚胎细胞核移植实验,1975年，Bromhall进行家兔克隆研究.其后，相继获得了小鼠、绵羊、牛、家兔、山羊和猪的胚胎细胞核克隆后代。1997年，“多莉”羊的诞生，标志着哺乳动物的体细胞核克隆时代的到来。小鼠、绵羊、牛、山羊和猪、骡、猫等均产生了体细胞的克隆后代。,转基因动物,20世纪70年代中期，基因重组技术与细胞工程技术结合，产生了转基因动物和转基因植物。1974年,HJaenisch和MinZe首次报道向小鼠囊胚注射SV40DNA后，生产的小鼠部分组织中检测到了SV40rDNA序列。1980年,Gordon等人通过向小鼠的单细胞胚胎原核注射纯化的DNA-人胸苷激酶基因，获得转基因小鼠。这是一只得真正意义的第一只转基因动物。,转基因硕鼠,1982年Palmiter等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中,获得比普通小鼠生长速度快24倍，震惊了世界。,转基因“硕鼠”（右）,生物反应器研发,在此后几年中，以改进经济性状为目的的转基因动物研究成为热点课题。但除转基因鱼外，多数转基因动物并没有达到预想的要求。在转基因动物进展滞缓这一时期，一个新的更有前途的领域-生物反应器悄然崛起，并取得了明显的进展。,Gordon于1987年获得了分泌组织纤溶酶原激活因子tPA的转基因小鼠。以后的数年内，转基因羊、猪、牛的乳腺生物反应器便相继问世，利用此生产出了多种生物药物：凝血因子、凝血因子XIII、抗胰蛋白酶、tPA、红细胞生成素（EPO）等。动物克隆技术、干细胞技术等与转基因动物技术相结合，加快了动物生物反应器的研究与应用进程。,乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊,美国转基因猪，其体内含有人类的基因，乳汁含有人体蛋白fator。只需300600只这样的母猪就能满足全世界对这种蛋白的需求。,0.2.2动物细胞工程所用的主要技术,0.3动物细胞工程发展趋势与应用前景,细胞工程学从Kohler和Milstein1975建立的制备单克隆抗体开始，迄今仅有30余年的历史。在这短短的30多年中，细胞工程学获得了引人注目的成就。显示了细胞工程的强大生命力。,0.3.1医学,哺乳动物（包括人类在内）有两类淋巴细胞，即B细胞和T细胞。B细胞能分泌抗体，具有体液免疫的作用（T细胞分泌淋巴因子，发挥细胞免疫的作用）。单克隆抗体:由某个特定的B淋巴细胞培养繁殖出的大量细胞群体所分泌的具有专一性的抗体。,(1)单克隆抗体,在单克隆抗体技术出现之前，要大批量生产蛋白质抗体供医学上诊断和治疗，遇到两个方面的困难：操作费时。需要大量免疫动物，再从免疫过的动物抽取血清。存在其它抗体干扰。从动物血清得到的抗体中，除了希望得到的抗某种抗原的抗体外，往往杂有其他抗体，把需要的抗体纯化出来，也是一个费时的过程。采用单克隆抗体技术从细胞培养中获取特异的单抗，使抗体的大规模实际应用成为可能。,单克隆抗体用于临床诊断英国科学家根据抗体能非常牢固地结合到塑料等物体表面的特性并保持其与抗原结合的能力，抗原再同放射性标记的抗体结合的原理，将放射免疫测定法与单抗技术结合用于疾病诊断，准确性非常高。,单抗的应用,血液中“甲胎蛋白”含量是检测肝癌的重要指标。第一，先将制作的甲胎蛋白单克隆抗体包被乳胶球，再加入待测样品（抗原）；第二，反应后，再加入带有放射性标记的甲胎蛋白单克隆抗体，它与已被结合在乳胶球上的抗原结合；第三，加入10%蔗糖溶液使乳胶球下沉；第四，待沉淀后，除去上清液；第五，根据待测乳胶球上的放射性含量判断是否患有肝癌。,MCAB诊断肝癌：,MCAB治疗癌症,当前采用的各种抗癌药物对细胞的选择性都比较差，往往将正常细胞与癌细胞一起杀死，副作用极大。近年来，人们根据单克隆抗体能与癌细胞选择性结合的特点，设想直接用单抗杀死癌细胞。但单抗与表面抗原稀少的癌细胞结合后，并不能直接溶解癌细胞，杀伤作用不强。科学家设想，将单抗作为运载治癌药物的导弹，把治癌药（如放射性同位素、毒素或免疫调节剂等）作为弹头，直接导航至癌细胞表面并与之结合，以便达到准确高效杀死癌细胞的目的。,例如，研究动物胚胎发育阶段。在胚胎发育过程中，不同发育阶段的细胞有着不同的细胞膜抗原，因此用不同膜抗原单克隆抗体，研究胚胎发育过程中组织分化、器官发生等。,单克隆抗体用作生物活性试剂,用DNA聚合酶A作单抗,发现间期细胞的DNA聚合酶A在细胞核内（说明DNA合成于间期）；M期的DNA聚合酶A由于核膜消失而分布到整个细胞质中。,以单克隆抗体为探针测定生物大分子在细胞内的位置,主要是避孕药物的研制。例如，以精子、卵子透明带和早期胚胎制备的单抗，作为免疫避孕疫苗进行免疫接种，达到避孕的目的。（3）制药业和诊断试剂与基因工程结合，生产生物药品。人胰岛素、幼畜腹泻疫苗、牛鸡生长激素、口蹄疫疫苗和150多种单抗试剂诊断盒等。进入临床试验或种间试验的有乙型肝炎疫苗、人绒毛膜促性腺激素、白细胞介素、细胞生成素等。,（2）计划生育和优生优育方面应用前景,热点研究课题：生物工程药物研发。全世界生物工程制药公司已超过2000多家。中国起步晚，但发展势头很猛。烟台:有大信、绿叶、荣昌、鲁银等生物制药公司。,生物活性肽是指那些有特殊生理活性的肽类。海洋生物蛋白资源无论在种类还是在数量上都远远大于陆地蛋白资源，并且未得到很好的开发。海洋存在许多极端环境，如高压（深海）、低温（极地、深海）、高温（海底火山口）和高盐等。为了适应这些极端的海洋生境，海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成或序列都与陆地生物蛋白有很大的不同。,海洋生物活性肽研究,生物防御素(Defensin)是近年来发现的一组新型抗菌活性肽。它们通常都是由3550个氨基酸残基组成，且分子内富含二硫键。由于其具有牢固的分子骨架、广泛的分布以及生物活性功能，因而对它们的研究已成为当前国际学术界中一个引人关注的研究热点。各类抗菌防御素不但在结构上具有相应的保守序列和相似的紧密空间构型，在功能上也都有相似的共性如：抗菌、抗病毒能力和细胞毒性作用等。,生物防御素(Defensin),（4）干细胞工程,是通过对“种子”细胞(干细胞),在体外进行定向诱导或基因修饰，让它变成病人所需要的功能细胞，然后移植到病人体内，替换坏死的细胞，从而修复病变的组织以治疗疾病。（5）胚胎克隆生殖性克隆：指人工把体细胞细胞核移植到去核卵细胞内，在经过一定处理後，使卵细胞发育成胚胎并形成一个完整的生命体。治疗性克隆。当细胞发展到囊胚阶段时，不把细胞放入子宫继续发育，而是把其中的胚胎干细胞在体外定向诱导、分化成各种组织和器官,实现治疗的的目的。,（6）解决不育问题的体外受精、试管婴儿（7）器官移植利用动物的器官代替人的器官，解决器官来源严重不足问题。研究表明人体异种器官移植，猪较为合适；首先,猪器官的大小与人的相当，生理上也比较接近；其次,猪在无病原体条作下比较容易饲养和容易保证无病的供体；此外,猪的繁殖率高，每窝可产十几只猪仔，存活率也较高。作为供体器官，来源充足。为了保证植入的器官不被排斥，生物学者正在培养“转基因猪”。最近，日本科学家培养出具有人血型的猪。,2002年1月，英国苏格兰罗斯林研究中心又培育出的5只转基因小猪。这种猪的一个基因阿尔法1号(GT基因)被“关闭”。,GT基因控制产生一种酶，这种酶使猪细胞表面产生一种蛋白质。当猪的器官移植进人体时，人类免疫系统能识别这种蛋白质，从而产生强烈的排异反应，这是目前动物器官不能应用于人体移植手术的主要障碍。,较早的用于异种器官移植的转基因猪,（1）转基因食品：-“转基因”：就是利用生物技术将某些动物的基因转移到其它物种中去，改造生物的遗传物质，使其出现原物种不具有的目标性状。例如，用鲜鱼（冷水鱼类）的基因能帮助西红柿、草莓等普通植物抵御寒冷；把某些抗性基因接入玉米、大豆植株中，能更好地保护它不受昆虫的侵扰，或使它们对一些除草剂产生免疫力。-转基因食品：以转基因生物为原料加工生产的食物就是“转基因食物”。转基因食品早已进入人们的生活。2003年我国进口了1000万吨以上的大豆，其中多数为转基因大豆。,0.3.2农、牧、渔、业,国外：出于安全性和考虑，欧盟国家2000年通过新法案，要求所有转基因食品、种子、饲料和药品必须有明显“Tag”。韩国从2001年对进口大豆、玉米以及含有这些成分的食品要求加贴“转基因”标识。国内：两种不同看法：一种:转基因食物是安全的。北大校长许智宏院士指出，转基因食品的安全性问题不在于转基因动植物本身，而在于转入基因是否合适。目前转进的大都是人们平常食用的动植物自身的基因。另一种:应注意其潜在的危险性。中国科学院技术部部长徐冠华院士认为，从纯技术层面讲，转基因技术是中性的，但有潜在的危险。,关于转基因的安全性,（2）品种改良,-目的是获得高产、优质和具有高抗性的优良品种。动物细胞工程育种方面，多倍体育种和雌核发育已在鱼、虾、贝等水产养殖动物上获得成功，有些已用于生产。在动物方面主要应用技术：精液冷冻、人工受精；用激素诱导母羊超数排卵；胚胎工程包括：胚胎移植、胚胎分割、胚胎嵌合；卵母细胞体外培养、体外受精；动物克隆；性别鉴定；干细胞研究；转基因动物等。,以棉铃虫为例，过去棉铃虫对棉花的危害很大，一般化学农药除杀。棉铃虫会产生抗性，非加大农药用量而不退，残留农药污染环境，破坏生态平衡。利用细胞工程结合其它生物技术：,（3）新农药和新兽药的研发,从自然死亡的棉铃虫体内分离到病毒,工厂化饲养棉铃虫幼虫并使其感染病毒,进一步加工后制成棉铃虫病毒杀虫剂,幼虫繁殖高峰到来之前喷洒该杀虫剂,死亡的棉铃虫体内病毒又会感染其他棉铃虫幼虫，达到防治目的。这种病毒对人畜也无害。,消灭棉铃虫,猪霍乱和猪伤寒是猪的两种烈性传染病，有人以两种菌苗为亲本菌，经过细胞融合获得杂种菌，试验表明，杂种菌对两