液相色谱条件的分析和建立

.,液相色谱条件的分析和建立主讲人:李效宽日期:2010年11月地点：武汉,.,.,HPLC分离原理,样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分与固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件),.,不同类型样品的方法选择,.,色谱柱的选择,根据分离方式分类(1)正相色谱：SiO2；CN；NH2(2)反相色谱：C18；C4；C8；CN；NH2；苯基(3)离子交换色谱：阳离子官能团：SO3H磺酸基、COOH羧基等阴离子官能团：R4N季铵基、-氨基等(4)凝胶色谱：水溶性凝胶过滤（GFC）；油溶性凝胶渗透（GPC）(5)其它类型：手性柱等,.,1.填料基质：硅胶、氧化铝、聚苯乙烯等2.键合相：C4、C8、C18、苯基、氨基、氰基等3.孔径：60-100A分子量20004.粒径：2um-10um5.内径：10mm以下（分析），10mm以上（制备）6.长度：100、150、250、300mm,色谱柱选择,.,色谱柱填料选择,粒度均匀（3，3.5,5um),粒径小，柱压高，理论塔板数高，容易堵柱。低酸度表面(硅醇基团被屏蔽），可以减少拖尾宽的pH范围，可以有较大的调节自由度,.,色谱柱选择,长度：75mm,150mm,250mm,压力和理论塔板正比与柱长内径：2mm,4.6mm,10mm粒径：3um,3.5um,5um孔径：100A,300A,.,流动相选择,溶剂截止波长(nm)水190乙腈190甲醇210乙醇210异丙醇210正己烷210四氢呋喃210二氯甲烷240氯仿240,.,甲醇和乙腈的紫外吸收图,线性范围和检出限度都有影响,.,不同混合溶剂的粘度比较,.,分离度（R1.5）和峰型（1.05T0.95）,.,可接受的分离条件K,可以接受的分离应该是1k20,or2k10better。K=(tr-t0)/t0T0指死时间，一般相当于溶剂峰出峰时间K与流速变化关系不大，K小受干扰大，k大则分析时间太长。,.,理论塔板数,.,分离度,w1,w2是峰1峰2的基线宽度W0.5,1,w0.5,2是峰1和峰2的半高峰宽,.,分离度与k（容量因子）的关系,所以分离的第一步就是控制1k20,或者最好是2k10方法：有机相100%,90%,80%,70每减少10%,k值变化为2.53倍,.,分离度80%-70%-60%,.,分离度（48%-47%-46%),.,更换有机相,a:甲醇-水b:THF-水c:甲醇：THF:水,.,总结,1调节有机溶剂比例(10%)使k值可以接受2微调有机溶剂比例(1%)，使分离完全3更换有机溶剂MeOH,THF,CAN4混合使用有机溶剂记录每一次条件变化对谱峰的影响,.,其他控制选择性的因素,流动相pH值柱温不同品牌色谱柱离子对试剂,.,流动相pH值,1,2酸性化合物4,5碱性化合物3中性化合物图中曲线的拐点为该化合物的pKapH57之间会有较好的分离，5附近比较稳定,.,流动相pH值,.,流动相pH值,.,pH值的影响(pka),一组苯甲酸(pka=4.2)同系物的分离情况A:pH2.5B:pH3.0C:pH3.5D:pH4.0,.,pH值的影响,pH值必须在该缓冲盐的pKa1以内才有较好作用，超过此范围，会使得色谱条件不稳定，重复性较差由此得出磷酸盐缓冲液可用于pH2.0-3.1,6.2.-8.2醋酸盐缓冲液可用于pH3.8-5.8,.,方式不同柱效不同,色谱条件色谱柱：KromasilC184.6250mm5um，柱温：室温，波长：203nm流速：1.0ml/min2.梯度：乙腈：水为流动相1.流动相：乙腈：水（22：78）为流动相0min20:80柱效:1150020min40:60人参皂苷Rg1(样品)柱效:60000,.,柱温的影响,温度变化1度，Rt变化13%A:30B:35C:40D:45温度控制对定量分析很重要,.,更换色谱柱的影响,AC8柱B苯基柱C氰基柱,.,更换色谱柱的影响,AC8柱B苯基柱C氰基柱由于更换色谱柱会影响峰的次序，所以这是最后的选择,.,流速的影响,A3umdpB5umdpC10umdp从左到右1,2,4ml/min改变流速对分离影响不大，但可以缩短分析时间,.,填料及外型影响,Dp：2.5um,3.5um,5um,10um（柱压，理论塔板数）长度：20,30,50,100,150,250mm（柱压，理论塔板数）内径：2.1,3.0,3.9,4.6mm（线速度）,.,a150mmP=1800psib250mmP=3000psi,柱长与柱压和RT成比例,.,改变粒度，长度，流速,150-mml,3-m，1-mL/min,1250psi100-mm,3-m，1-mL/min,825psi100-mm,3-m2-mL/min,1650psi,.,缓冲盐（离子强度调节）的影响,色谱柱：DionexacclaimC18，5um，250*4.6mm流动相：CH3CN:(NH4OAc溶液,pH5.2）20:80检测波长：280nm流速：1.0ml/min1050mM浓度,.,检测器的影响,.,检测波长的影响,.,二.色谱条件的开发,.,色谱条件开发的目标,二高一低：专属性高、准确度高、成本低是一个色谱工作者追求的目标。在尽量短的保留时间内得到最佳的峰型、合适的分离度。,.,等度洗脱的特点,优点操作简单、方便重现性好缺点不适合某些复杂物质,.,梯度洗脱的特点,优点分离能力增加检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式,.,等度和梯度获得柱效不同,色谱柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm，柱温：25，波长：203nm流速：1.0ml/min样品：人参皂苷Rg11.等度：乙腈：水（22：78）为流动相2.梯度：乙腈：水为流动相0min20:8020min40:60,.,等度和梯度获得柱效不同,柱效2.1万,柱效6万,.,艰难的选择,分离度分析时间系统压力在三者之间作出最符合实际情况的选择,.,快速寻找方法的起点,传统的建立方法模式需要较长的时间，100%，90%,现代仪器多为三元或两元泵系统，可以方便的在整个流程中自由的变化比例，因此可以通过探索性梯度运行来寻找最佳方法入口。,.,确定梯度运行的方法,设计一个30分钟的运行，推荐条件：250*4.6mm5um1.0ml/min甲醇0min5%30100%35100%,.,一个实例,tg第一个谱峰和最后一个谱峰的时间差Tg整个梯度运行时间tg/tg0.4梯度tg/tg=（28.6-18.3)/30=0.34，因此可以分别尝试,.,由梯度变换为等度,平均保留时间t=(18.3+28.6)/2=23.5陡度=(100-5)/30=3.17等度比例=5+3.17*23.5=79%,.,等度（79%)运行结果（考虑K?）,.,由梯度变换梯度(K?),第一个谱峰18.3对应5+3.17*18.3=63%(18.3-2.5)/2.5=6.32,6.32/3=2.1(K=1)最后一个谱峰28.6对应5+3.17*28.6=95%梯度时间为100-5=95-4230XX=16min,陡度不变,.,第二次梯度运行结果,TimeB%04216952095,.,液相色谱的方法开发,（二）梯度方法,.,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,.,梯度一般方法,.,梯度洗脱的可变参数,梯度的陡度梯度的变化形状,.,如不用梯度：分离不理想,.,梯度条件的优化,.,梯度曲线的变化凹线,.,梯度曲线的变化凸线,.,梯度方法开发实例-第一步,开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100%水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好。,.,梯度方法开发实例-第二步,为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。,.,梯度方法开发实例-第三步,从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。,.,梯度方法开发实例-第四步,空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。,.,梯度方法开发实例-第五步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。,.,梯度方法开发实例-第六步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。,.,梯度方法开发实例-第七步,最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。,.,.,色谱应用实例欣弗事件,色谱柱：EclipseXDB-C84.6250mm5um（国家标准）流动相：(取磷酸二氢钾10.54g，溶于775ml水中，用磷酸调pH值至2.5)-乙腈检测波长：210nm柱温：25流速：1.0ml/min,克林霉素磷酸酯,775225,8218,.,色谱应用实例欣弗事件,色谱柱：EclipseXDB-C84.6250mm5um流动相：(取磷酸二氢钾10.54g，溶于775ml水中，用40%氢氧化钾调pH值至5.6)-乙腈(775225)为流动相检测波长：210nm柱温：25流速：1.0ml/min分离度大于6,克林霉素磷酸酯,克林霉素,.,色谱应用实例【三聚氰胺(牛奶事件),色谱柱：VenusilASB-C184.6*250,5um;（FDA标准）流动相：(10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0)：乙腈=85：15检测波长：240nm柱温：40流速：1.0ml/min分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3分子量：126.12含氮量：66.6%,.,色谱应用实例（紫杉醇注射液）,色谱柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm（黄金植物）流动相：乙腈-水（40：60），洗脱至主峰出完（约27分钟），然后以每分钟1.6%的速度增加乙腈的比例，25分钟后，乙腈比例增至80%，再以每分钟4%的速度降低乙腈的比例，10分钟后，乙腈比例降至40%，保持此比例10分钟。检测波长：227nm流速：1.0ml/min,紫杉醇,.,色谱应用实例（紫杉醇注射液）,色谱柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm流动相：甲醇-水-乙腈（30：40：30）检测波长：227nm流速：1.0ml/min,炔诺酮,紫杉醇,.,色谱应用实例（血塞通崩解片）,色谱柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm，波长：203nm时间（min）乙腈水020%80%2040%60%2120%80%2620%80%,三七皂苷R1,人参皂苷Rg1,人参皂苷Rb1,.,色谱应用实例（胆酸钠原料）,色谱柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm，波长：205nm时间（min）乙腈0.2%磷酸二氢钾溶液(磷酸调PH值至2.5)025%75%3040%60%4040%60%5025%75%,指纹图谱,.,色谱应用实例（抗生素）,色谱柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm，波长：254nm流动相：乙腈：（三乙胺14ml，加水100ml,醋酸调PH值至2.5)=18：82流速：1.0ml/min样品：注射用头孢哌酮钠,对照品,样品,1.头孢哌酮降解物B2.头孢哌酮3.头孢哌酮S异构体,.,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱：UtimateTMXB-C184.6250mm5um，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇溶液（3367）柱温：40流速：1.0ml/min（杂质A+光照）,.,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱：UtimateTMXB-C184.6250mm5um，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇溶液（3367）柱温：40流速：1.0ml/min（样品）,.,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱：UtimateTMXB-C184.6250mm5um，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇溶液（3367）柱温：40流速：1.0ml/min（中间体+样品）,.,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱：UtimateTMXB-C184.6250mm5um，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇溶液（3367）柱温：40流速：1.0ml/min（样品光照）,.,色谱应用实例（多糖）,色谱柱：凝胶柱（水相），流动相：水检测器：RID柱温：25流速：1.0ml/min,1,2,3,4,Mn1：19340002：1085003：69304：550,.,有机碳,0,5,10,15,C14,C6,C7,C8,C10,C11,C12,C5,C13,C9,柱子:5m,DimensionsC18,4.6x150mm,流动相:ACH3CN,B-H2O流速：1.0mL/min0min30%70%柱温：30C15min80%20%检测器：ELSDetector20min80%20%,.,色谱应用实例（维生素）,色谱柱：硅胶键合NH2柱，150*4.6m