液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用

1,AgilentLC-MS/MS6420,2020/5/30,.,2,内容,1.LC-MS/MS的基本原理2.方法开发流程及优化3.电离影响因素与溶液化学4.注意事项,2020/5/30,.,3,1.LC-MS/MS的基本原理,.,4,ESIionsource,2020/5/30,.,5,2020/5/30,.,6,Front-endionoptics,2020/5/30,.,7,Quadrupole,2020/5/30,.,8,Collisioncell,N20.5ml/min,2020/5/30,.,9,Rearquadrupoleanddetector,.,10,Pumpingsystem,2torr10-210-310-5torrtorrtorr,2020/5/30,.,11,2.LC/MS/MS方法开发流程,1电离模式的选择2查阅文献，参考样品前处理的技术路线和色谱分离条件、质谱参数条件等。3MRM参数优化使用标准品优化fragmentor和collisionenergy4离子源参数的优化（源温度、流速）5LC分离方法的优化，1-3min为理想,2020/5/30,.,12,MRM参数优化,扫描（MS2Scan）,2020/5/30,.,13,选择离子监测（SIM）,优化毛细管出口电压（fragmentor），保证母离子的传输效率,2020/5/30,.,14,子离子扫描（ProductIonScan）,使用已优化好的fragmentor，选择定性定量离子，优化碰撞能量（collisionenergy），得到/优化子离子的响应，每个化合物一般选择两个强度最高的子离子，分别作定性离子与定量离子,2020/5/30,.,15,多反应监测（MRM）,使用已优化好的fragmentor和collisionenergy，优化Dwelltime,2020/5/30,.,16,Dwelltime优化,2020/5/30,.,17,Dwelltime优化,2020/5/30,.,18,DynamicMRM,标准MRM对多组分，出峰时间波动，灵敏度低。dMRM适合应用于多组分同时分析，自动优化分配DwellTime，兼顾灵敏度与数据采集质量！,2020/5/30,.,19,thenumberofMRMsatanytimearemanyfewerthanwithtimesegmentmethods,allowingmuchfasterMScycletimes,.,20,3.电离影响因素与溶液化学,溶液的化学性质流动相被分析物基质的性质喷针内部针的位置针的状况雾化气压力高电压电极毛细管和喷雾室电压设置毛细管和喷雾室高压部件的状态绝缘体的状态,2020/5/30,.,21,离子模式的选择,正离子ES模式适合于碱性样品，amines，amides，aminoacids，antibiotics等酸性流动相负离子ES模式适合于酸性样品，acids，hydroxyls，含强负电性基团有杂原子，可失去质子。如COOH、OH中性偏碱性流动相可正可负比较灵敏度,2020/5/30,.,22,溶剂匹配,反相溶剂：甲醇、乙腈、水兼容液质的盐（常用）：甲酸、乙酸(0.01-1%)、甲酸铵、乙酸铵(小于20mM)慎用：三氟乙酸等不兼容盐硼酸盐、硫酸盐、磷酸盐（不挥发或易形成离子对）,2020/5/30,.,23,流动相中添加剂,正离子模式-甲酸、乙酸和三氟乙酸（慎用）负离子模式-氨水正离子负离子-甲酸铵或乙酸铵（不高于20mM）,2020/5/30,.,24,电喷雾-离子对的形成,对正离子检测，由于离子对的形成，是溶液或气相中的离子中和！M+H+A-M+H+A0A=B,S,P有利于中性产物A=甲/乙酸盐有利于生成带电物质离子对强度：B,S,P三氟乙酸乙酸盐，甲酸盐,2020/5/30,.,25,电喷雾-离子对的形成,对负离子，由于离子对的生成，使溶液或气相中的离子中和！M-H-+C+M-H+C0C=Na,K,Li有利于中性产物C=NH4+有利于带电物质,2020/5/30,.,26,ESI:离子竞争机制,表面竞争被分析离子与电解质离子转换为气相离子的竞争使被分析物相应降低。电荷竞争OAc+AH+HOAc+A,2020/5/30,.,27,4.注意事项,使用0.22um孔隙滤膜过滤流动相含水50%,适当提高干燥气体的流速和温度选择母离子：准分子离子，M+H+、M-H-优先，避免选择加和离子M+Na+,所需能量较低，灵敏度好。子离子的选择：高质量端的特征离子。,2020/5/30,.,28,气相离子的产生,表面活性高（具低溶剂化能）的离子优先转移至雾滴表面，最终转变为气相离子-竞争机制应采用表面活性低的缓冲盐低浓度的挥发性的酸、碱及缓冲盐,2020/5/30,.,29,小结：流动相的考虑,金属离子缓冲盐影响离子化表面活性剂影响去溶剂化离子对试剂可以离子化，而导致高背景噪音强离子对试剂可与待测物反应，导致待测物不能离子化TEA干扰正离子模式(m/z102)TFA扰负离子模式(m/z113)增塑剂（邻苯二甲酸酯）背景干扰，(m/z149,315,391),2020/5/30,.,30,API质谱图的解释,检测到的离子种类依赖于溶剂添加剂和分析所用的条件。,2020/5/30,.,31,名义分子量和平均分子量,对于分子C6H3Cl3平均分子量为6(12.01115)+3(1.000797)+3(35.453)MW=181.4286(12.000)+3(1.00078)+3(34.9989)=179.9990精确质量/单同位