第九章-----哺乳动物配子与胚胎生物工程

第九章哺乳动物配子与胚胎生物工程,第一节胚胎移植技术,胚胎移植技术,一、概述二、胚胎移植的生理学基础与基本原则三、胚胎移植的技术程序四、胚胎的保存五、影响胚胎移植妊娠率的因素六、胚胎移植存在的主要的问题七、胚胎移植技术发展前景,一、胚胎移植技术的概述,概念：胚胎移植又称受精卵移植，俗称借腹怀胎。胚胎移植技术将体内，体外生产的哺乳动物早期胚胎移植到同种的，生理状态相同的雌性动物生殖道内，使之继续发育成正常个体的生物技术。发展简史：1.试验研究阶段1890年，英国剑桥大学的WalterHeape教授以家兔为材料，成功地使用了胚胎移植技术产出了安哥拉仔兔。2.实际应用阶段20世纪60年代，以牛为主的胚胎移植技术发展迅速，70年代胚胎超低温冷冻技术成功，它就打破了时间和空间的局限。1974年国际胚胎移植协会成立了。3.产业化开发阶段近30年来，牛羊甚至是人的胚胎移植技术已日完善，所有设备药物溶液等都实现专业化生产和商业销售，培养了大批操作人员。我国的胚胎移植技术的水平也达到了发达国家的水平，进入了产业化应用阶段。,胚胎移植在畜牧生产上的意义：,1，充分发挥良种母畜的繁殖潜力，提高繁殖效率2，加速品种改良，扩大良种畜群3，加速育种进程4，简化良种引进方法5，降低种质资源保存费用6，诱产双胎，提高生产效率7，克服不孕8，利于防疫9，促进生殖生理理论与胚胎生物技术的发展,二，胚胎移植的生理学基础与基本原则,胚胎移植的生理学基础：1.母畜发情后生殖器官的孕向发育大多数自发排卵的家畜发情后不论是否配种，或配种后是否受精，生殖器官都会发生一系列的变化，受胎的母畜生殖系统朝着妊娠的方向继续发生变化以适应胚胎发育的需要。2.早期胚胎的游离状态早期胚胎游行到子宫角的时候它所需要的营养物质都会来于自身的贮存，此刻把它取出来移入同种的母体时，它进一步地发育成新个体。3.子宫对早期胚胎的免疫耐受性早期胚胎在妊娠期发生了一些免疫变化，而具有一定的耐受性，就此把它移到别的母体时不会发生免疫排斥反应。4.胚胎遗传物质的稳定性早期胚胎的遗传物质就在受精的时候由公畜或母体决定的，故把它移植到别的母体时不会受到第二个母体传下的遗传物质的影响，代孕母体只影响新个体的体质发育。,胚胎移植的基本原则：,1.胚胎移植前后环境的同一性（）1胚胎供体与受体种属上的一致性二者应该属于同一个“种”。（2）生理上的一致性二者在发情时间上的同期性。（3）胚胎发育阶段与移植部位的一致性胚胎移植的时候，从供体输卵管或子宫内取出来的胚胎应该移植到受体的输卵管或子宫内。2.胚胎的发育期限把胚胎取出母体最理想的时间在发情配种后的38d左右，而受体也在同一时间内能接受的。3.胚胎的质量形态，色泽要正常。质量低劣的胚胎会早退化的。4.经济效益或科学价值使用胚胎移植技术的时候应该考虑成本和最终收益。平时，供体胚胎应该具有比较独特的经济价值，生产性能优异或科研价值重大。,胚胎移植应具备的条件：,1.实验室条件环境温度，溶液的酸碱度，渗透压，化学药物的纯度，技术人员的基本素质，空气洁净，设备齐全，布局合理的实验室才能提高胚胎移植的效率。2.技术条件胚胎移植的每一个过程都需要丰富的经验。因此，开展家畜胚胎移植生产至少需要临床兽医和胚胎工程技术两类人员。前者负责供体和受体选择，处理，胚胎采集与移植等兽医临床工作；后者负责溶液准备，检胚，胚胎等级鉴定，胚胎冷冻和解冻等实验室操作工作。3.胚胎来源充足的胚胎供应是实施胚胎移植产业化的前提。目前胚胎的来源主要是通过超数排卵处理后由供体子宫内采集和体外受精两种方法获得。,三，胚胎移植的技术程序,供体和受体母畜的选择：1.供体应该为良种的母畜，具有较高的育种价值，谱系清楚，遗传性能稳定；要有良好的繁殖机能和健康状态，处于能量正平衡，体况中上等；一般应有2个或2个以上正常的发情周期。而超熟排卵处理反应良好的母畜可以反复使用为供体；2.受体这个可以不考虑遗传特性，但应该有良好的繁殖性能和健康状态，体况中上等，一般应该有2个或2个以上正常的发情周期，不能有繁殖机能疾病和传染病；,同期发情：,采用外源生殖激素等方法使一群母畜在同一时期内发情并排卵的技术，称为同期发情；牛的同期发情孕激素（皮下埋植法或阴道栓给药）和前列腺素（肌肉注射）是诱导同期发情最常用的激素；1.孕激素阴道栓塞法2.孕激素埋植法3.前列腺素法,供体超熟排卵：,1.概念及原理在母畜发情周期的适当时间，注射外源促性腺激素，使卵巢比自然发情时有更多的卵泡发育并排卵，这种方法叫做超熟排卵，简称超排；母畜卵巢上约有99%的有腔卵泡发生闭锁而退化，只有1%能发育成熟而排卵；2.超熟排卵方法（1）FSH+PG法牛和绵羊在发情周期的第913天中的任何一天的时候通过肌肉注射促卵泡素（FSH），递减法连续注射4天每天间隔12小时等量注射2次。在第5次注射促卵泡素的同时，肌肉注射前列腺素（PG），以溶解黄体。注射后2448小时内发情。（2）CIDR+FSH+PG在发情周期的某一天给供体牛，羊的阴道内放入CIDR,计为0天，重复第一个过程，在第7次肌肉注射促卵泡素时取出CIDR,还要注射PG，之后的2448小时内发情。,（3）PMSG+PG法在发情周期的第1113天中的任何一天肌肉注射孕马血清促性腺激素（PMSG），之后的48小时肌肉注射PG，以溶解黄体。之后的2448小时内发情。3.提高超熟排卵效果的措施（1）选择合适的畜群和个体（2）采取规范的饲养和管理（3）采用优质药品和科学方案,供体母畜的配种：,一般供体在超熟排卵处理结束后1248小时表现发情，根据育种的需要，选择优良公畜或它的精液适当的时候进行配种。为了得到较多的发育正常的胚胎，应该使用活率高，密度比较大的精液，而且可适当地增加人工授精的次数和每次输精的剂量，两次输精间隔810小时。,胚胎的回收：,胚胎的回收有称为胚胎采集或冲胚，它是：利用特定的溶液和装置将早期胚胎从母畜的子宫或输卵管中冲出来并回收利用的过程。回收的方法有两种：手术法和非手术法手术法中小型家畜（羊，猪，兔）非手术法大型家畜（马，牛）胚胎回收的环节以如下：冲胚液的配置与灭菌冲胚器械的准备供体母畜的检查与麻醉冲胚操作,1.冲胚液的配置与灭菌冲胚液是：从母畜生殖道内冲取胚胎和进行胚胎体外短时间的保存，并与胚胎细胞等渗的溶液。最常用的是杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）。它的主要成分是包括：无机盐，缓冲液，能量物质，抗生素和大分子物质。在此无机盐的主要作用是：保证溶液的离子平衡和维持渗透压；缓冲液的作用是：维持冲胚，胚胎操作和移植过程溶液渗透压，PH的的稳定性；能量物质的作用是：为胚胎的体外生存提供能量；抗生素的作用是：防止胚胎和冲胚液受到病原微生物的污染；大分子物质的主要作用是：防止胚胎黏附到冲胚管或保存胚胎的器皿上有的还具有调节胚胎发育的作用；,2.冲胚器械和药品的准备冲胚的时候需要的主要器械和药品是：（1）牛用的或羊用的二路式（三路式也可以）冲胚管；（2）外科手术器械，如手术刀，手术剪刀，止血钳，肠钳，缝合针，缝合线，剪毛剪，注射器等；（3）保定架或手术台；（4）药品包括：消毒药品，如75%的酒精，碘酊，新洁尔灭，高锰酸钾，麻醉药品，生理盐水和抗生素等。而冲胚前所有使用器械要要进行灭菌处理，使用前在无菌间用冲胚液冲洗消毒后的冲胚管及其连接导管，集卵杯等。冲胚液在37摄氏度的水浴锅或恒温箱中预热，备用。,3.手术法回收胚胎小型的家畜通过外科手术将它们的子宫角，输卵管和卵巢部分暴露，然后注入冲胚液从子宫角或输卵管中冲取早期胚胎。（1）手术前的准备一定要求在术前1天对供体停食空腹，并限制饮水。（2）麻醉与保定肌肉注射速眠新进行快速全麻，待手术结束后再通过颈静脉注射苏醒快速解麻，效果也比较好。（3）手术部位与方法已经准备好了的供体的乳房前腹中线，切口长一般为45cm，暴露出子宫，输卵管与卵巢；按冲胚部位的不同分以下两种方式：1）输卵管采胚法：胚胎还处于输卵管时，可以采用此方法采集胚胎。2）子宫角采胚法：胚胎处于子宫的时候可以使用这个方法；,（程序）,4.非手术法回收胚胎大型家畜是由非手术法来回收胚胎的；它的具体操作如下：（1）供体牛的检查与处理供体牛在冲胚前，通过直肠检查两侧卵巢上的黄体数；并在冲胚前禁水，禁食1024小时，以减轻冲胚操作时腹压和瘤胃压力的影响。（2）保定，消毒与麻醉冲胚室内的温度要保持在20摄氏度左右；在冲胚前把供体站立保定于保定架内，剪去尾根的被毛，用酒精消毒后还用2%的盐酸利多卡因进行外麻醉，使母畜安定。（3）回收方法如书讲！243页,胚胎质量鉴定：,1.形态学法3060倍的实体显微镜下或120120倍的生物显微镜下观察胚胎质量；1）卵子是否受精；2）透明带形状，厚度，有无破损；3）卵裂球的致密程度，卵黄周隙是否有游离细胞或细胞碎片，细胞大小是否有差异；4）胚胎的发育程度是否与胚龄一致，胚胎的透明度，胚胎的可见结果是否完整等；,2.荧光活体染色把待鉴定的胚胎加入二乙酰荧光素培养，活体有荧光，死去的胚胎就没有荧光。,3.测定代谢活性法将待鉴定的胚胎加入葡萄糖溶液培养1h，测定葡萄糖的消耗量；每培养1h消耗葡萄糖25Ug以上者为活体；胚胎细胞发育阶段正常的和不正常的理解一下书的内容；,胚胎移植：,1.手术移植法这手术部位和方法与供体的冲胚过程一致的；2.非手术移植法（大型家畜）方法主要是用移植枪将胚胎移入有黄体侧的子宫角内；供体与受体术后的处理与观察：供体回收胚胎后，肌肉注射氯前列烯醇以溶解黄体，促进供体生殖器官的恢复。要肌肉注射青链霉素消炎3天。对术后的受体加强饲养管理，注意补足充量的维生素，微量素，避免应激反应。,四，胚胎的保存,异种活体保存：胚胎保存是指将胚胎在体内或体外正常条件下，暂时储存起来而不使其失去活力。不同种动物的受精卵保存在不同种动物的子宫或者输卵管内使它继续发育而将不失去活力叫异种活体保存。常温保存：指胚胎在1525的培养液中保存。,低温保存：,是指将胚胎保存在05的低温环境中；此时胚胎卵裂暂停，代谢速度减慢，但它的活力不会停止的；超低温冷冻保存：1.常规冷冻法它是指将胚胎移入含低浓度抗冻剂的冷冻保存液中，通过程序冷冻控制仪使胚胎缓慢降温，以诱导胚胎外液形成冰晶，胚胎内形成玻璃化状态，而使胚胎存活的技术。2.玻璃化冷冻法它是将胚胎放入高浓高度抗冻剂的冷冻保存液中，通过降温使胚胎内外溶液形成玻璃化状态，从而阻止胚胎内冰晶形成时造成的物理和化学