环境生物工程2

耐热细菌生物脱有机硫模式反应体系的研究,提纲,生物脱硫的意义和背景微生物脱硫的途径我们的研究进展生物脱硫的实际应用,1.生物脱硫背景,环境问题已成为影响人类生存的重大问题，化石燃料煤和石油中所含有的硫是环境的主要污染源之一。微生物脱硫操作简单，成本低。脱有机硫是一个世界性难题，已受到广泛关注。,化石燃料煤和石油中所含有的有机硫和无机硫是环境的重要污染源,严重性1998年我国有一半以上城市降水pH低于5.6。华中地区酸雨出现频率大于70%，降水的年均pH低于5.0，酸雨面积占国土面积的30%，是继欧洲、北美后世界第三大中酸雨区。迫切性随着能源危机的逐步加剧，开采高硫化石燃料成为必然。高硫化石燃料必须预先经过脱硫处理才能进一步使用。,煤炭的化学结构模型,石油大分子的放大结构图,有机硫类型,有机硫化物包括硫醇、硫化物及含硫的杂环化合物如噻吩等，共分为13类,包括176种不同结构，其中噻吩含量最多。,炼油过程中物理和化学的除硫成本大,原油中大多数的H2S是在油井现场的油气分离过程中除去的。在炼油厂采用催化裂解和加氢脱硫(HDS)过程，加热到350C后蒸馏除去结合硫，但这些技术需高温、高压，且能耗大。目前相当多的资金用于石油的物理化学法脱硫上，1993年全世界用于HDS过程的资金达250亿美元。到下个世纪，随着需求的增加和低硫原油的耗尽，高硫原油将不断增加，因此石油脱硫成为必然。,生物脱有机硫的优势,BDS在常温常压下操作，而且能耗比HDS低70%-80。该过程还可回收有机磺酸盐等高值化学品，可为炼油厂增加经济效益。采用BDS技术的投资额约为加氢脱硫技术(HDS)的一半，操作费用比HDS低10%-25%。据报道，采用BDS可使FCC汽油的硫含量从1400ppm降至150ppm(以满足整个汽油组分平均硫质量含量为50ppm的要求)。从整个汽油组分来讲，炼油厂每m3成品汽油的BDS成本1.59-2.65US$，低于HDS成本。,2.微生物脱硫的途径,以二苯并噻吩为模式化合物的脱硫途径以苯并噻吩为模式化合物的脱硫途径以噻吩为模式化合物的脱硫途径,二苯噻吩(Dibenzothiophene,简称DBT)被作为一个脱有机硫模式化合物来研究,在高馏分油中，超过60%的硫是以二苯噻吩(Dibenzothiophene，简称DBT）及其衍生物的形式存在的，因此实验室一般使用DBT作为生物脱硫研究的模式化合物。,生物脱有机硫代谢途径类型,(1)碳架破坏途径(C-C键被切断)(2)碳架保留途径(专一地切断C-S键而保留完整的碳架),(1)碳架破坏途径(C-C键被切断),(1)碳架保留途径(专一地切断C-S而保留完整的碳架),苯并噻吩（Benzothiophene，BTH）脱硫代谢途径,FCC汽油中主要的含硫有机化合物包括BTH及其衍生物，其中BTH占30%。Finnertyetal.（1983）报道了几株可以利用BTH为专一硫源和碳源进行生长的菌株，不过由于其损失燃料热值而没有应用价值。近几年发现能够了专一性降解BTH菌株，主要包括戈登氏菌株，类芽孢杆菌，中华根瘤菌以及红球菌。,FCC汽油中硫化合物的分布及炼制油品要求,微生物脱有机硫BTH降解途径,A是BTHB是BTHsulfoxideC，D是BTHsulfoneF是benzoe1,2oxathiinS-xoideE是o-hydroxystyreneG是2-(2-hydroxyphenyl)ethan-1-al微生物包括：戈登氏菌株（Gordoniasp.）213E类芽孢杆菌（Paenibacillussp.）A11-2红球菌（Rhodococcussp.）T09中华根瘤菌（Sinorhizobiumsp.）KT55红球菌KT462,噻吩（Thiophene）代谢,噻吩代表了最简单的杂环含硫化合物。生物处理方法，一般都会导致噻吩的降解，而得到开环的化合物。至今还没有报道通过硫专一途径脱除噻吩中硫的菌株。,其它含硫化合物的代谢,硫醇和烷烃化的硫醇。菌株为排硫硫杆菌（Thiobacillusthioparus），可以通过甲基硫醇氧化酶作用，氧化硫醇定量生成甲醛，S0和过氧化氢。,我们的研究进展,筛选获得一株可以脱硫的耐热菌株分析了菌株脱硫的途径克隆了菌株脱硫的基因进行了燃料油脱硫实验室小试,微生物脱有机硫研究的关键,在众多的文献报道和最新的情报资料中我们注意到以下几点：(1)有价值的菌株的获取。我们不能用世界上已被专利保护的菌株用于将来实际的生物脱有机硫工艺中。(2)由于生物脱有机硫技术主要将被用在石油行业上，我们认为所用的菌株最好是耐热性微生物。,嗜热耐热性微生物的优势,I.石油炼制过程中的精馏后，即使在HDS后的油品温度也较高。如用耐热性的微生物可省去冷却过程所带来的麻烦，并可提高生物脱有机硫的反应速率；II.耐热微生物所含有的耐温酶类具有重要的生产潜力和应用前景。脱有机硫的耐热微生物酶催化剂热稳定好，反应速度快，较一般常温微生物优势明显；III.已发现的具降解DBT能力的微生物(如红平红球菌、诺卡氏菌)耐热能力较差，仅能在30oC附近生长和脱硫;一些耐热能力较强的假单胞菌、嗜酸热硫化叶菌等微生物能在50oC左右降解DBT，但均仅能攻击C-C键，而不能有效脱除DBT中的有机硫；IV.有必要寻找能耐热、能有效攻击C-S键的微生物，如能从自然界筛选到耐热性具碳架保留途径的脱有机硫菌株最佳，并可填补这一领域的研究空白，具有重要的理论价值和应用前景。,菌株特性研究,根据16SrDNA序列分析，在NCBI上检索相近的序列，然后建立系统进化树，菌株X7B和Mycobacteriumgoodii有最近的亲缘关系。,Phylogenetictreesbasedupon16SrDNAsequencesofX7B,X7B,菌株脱硫途径分析,菌株X7B可以脱除DBT中的硫，生成2-hydroxybiphenyl，该物质进一步被O-Methyltransferase作用，在羟基上甲基化，生成了2-methoxybiphenyl，总结其代谢途径如图。,菌株X7B代谢DBT的途径,OMT,针对Benzothiophene，作为模式化合物，进行了降解分析，表明菌株可以利用BTH为唯一硫源生长并脱除其中的硫生成了O-羟基苯乙烯(图)。,菌株X7B代谢BTH的GC/MS分析,菌株X7B代谢BTH的GC/MS分析,菌株X7B代谢BTH的GC/MS分析,菌株X7B代谢BTH的途径,o-hydroxystyrene,菌株脱硫研究进展,以Thiophenecarboxylicacid为模式化合物，进行了菌株代谢THC的途径分析。,菌株代谢THC分析,推测的THC代谢途径,菌株脱硫基因克隆,根据已经发表的红平红球菌IGTS8的脱硫基因序列，设计引物，进行PCR扩增获得了脱硫基因。将脱硫基因连接到T载体上，在大肠杆菌宿主进行表达，结果表明菌株可以利用DBT为唯一硫源进行生长，并能够脱除其中的硫生成2-HBP。同时表明不和X7B菌株一样，没有生成2-MBP。证明甲基化的性状是和另外的酶相关。,菌株脱硫基因克隆,根据脱硫基因测序结果，在NCBI检索DszC酶的同原性序列并进行了分析，结果如图。Arensforf等（2002，68(2):691-698,Appl.Environ.Microbiol.）报道，通过定向进化技术，筛选获得一株菌株，可以作用于5MBT，基因测序结果表明，因为一个碱基由G变成T，导致DszC的261位氨基酸突变（V261F）。,DszC酶的系统进化树,下一步，计划分别克隆表达DszA，B，C酶。准备使用pET表达型载体，并使用镍柱进行亲和纯化。,高密度培养脱硫催化剂进行燃油生物脱硫试验,高密度培养脱硫催化剂进行柴油脱硫试验进行汽油脱硫试验,(I)高密度生长和酶诱导二步式工艺：即解除培养中的硫源限制，先用廉价的无机硫酸盐代替有机硫，采用pH、碳源等最优控制技术，使菌体生长产量达到最大(高密度菌体生长)，再用少量的有机硫诱导菌体以制备酶源。(II)高密度生长和酶诱导一步式工艺：用少量的有机硫作为酶系产生的诱导物，用无机硫作为非限制性硫源高密度生产菌体和过量生产该脱硫催化剂。,BiostatB2,pO2(%),time(h),BiostatUD50,MFCSControl,bfxhgf,xc,hg,f,生物脱有机硫催化剂优化生产,高浓度脱硫细胞培养优化,不同碳源对菌株生长的影响,高浓度脱硫细胞培养优化,不同的浓度甘油对生长的影响,高浓度脱硫细胞培养优化,不同的氮源浓度对生长的影响,高浓度脱硫细胞培养优化,pH值恒定流加碳源菌体生长及在线检测参数曲线,处理柴油（535ppm）含硫化合物检测,X7B休止细胞作用于柴油后，GC-AED检测含硫化合物变化。,535ppm,72ppm,柴油（535ppm）中烷烃变化情况,GC-FID检测柴油经过生物催化剂处理前后烷烃变化，图中显示烷烃为C12-C25。,BDS汽油脱硫优点,投资成本比HDS低50，操作成本低15-25使用BDS不会降解汽油中的辛烷BDS不需要高温高压，可以减少能源消耗不产生H2S等副产品HDS促使汽油中的一些烯烃饱和，从而降低汽油的辛烷值,汽油脱硫前后含硫有机化合物的变化,汽油脱硫前后烃类物质变化情况,脱前,脱后,4.实际应用情况,BDS可广泛用于处理汽油、馏分油、催化裂解原料油、渣油。采用EBC新技术，还可以生产高价值化学品，增加脱硫的经济效益。休斯顿能源生物公司（EBC）自从1992年买断了IGT的脱硫技术以来，约投资了5,500万美元用于研究，使生物脱硫技术有了长足的发展。,BDS脱硫