分离工程课件

,生物分离工程,生物技术有机体的操作和应用有机体生产有用物质、改善人类生存环境的技术。生物技术的主要目标是生物物质的高效生产，而分离纯化是生物产品工程的重要环节。在生物技术领域，一般将生物产品的生产过程称为生物加工过程，包括优良生物物种的选育、基因工程、细胞工程、生物反应过程及目标产物的分离纯化过程，后者又称为下游生物加工过程（=生物分离工程）。生物分离过程特性主要体现在生物产物的特殊性、复杂性和对生物产品要求的严格性上，其结果导致分离过程成本往往占整个生产过程成本的大部分。,生物分离过程的设计原则：考虑目标产物存在的位置和存在形式根据产物性质（分子大小、疏水性、溶解度等）选择分离纯化技术生物加工过程的规模、目标产物的商业价值和对纯度的要求也是选择分离纯化技术的重要因素,生物物质,常见的生物物质：抗生素、有机酸、氨基酸、多肽、蛋白质(包括酶、抗体)、核苷酸、聚核苷酸、核酸、病毒、糖类、脂类、生物碱、糖苷等，其中与人类健康直接相关的生物大分子类治疗药物(蛋白质、核酸)和疫苗是现代生物分离工程眼就的主要内容。蛋白质药物生物技术产品的主体细胞因子激素抗体药物疫苗,生物分离过程,生物分离过程的特点：生物物质的生物活性大多是在生物体内的温和条件下维持并发挥作用的，当遇到高温、pH值的改变以及某些化学药物存在时极不稳定，容易发生活性降低甚至丧失(变性失活)。同时，原料液中常存在降解目标产物的杂质。因此，必须设计合理的分离过程和操作条件，实现目标产物的快速分离纯化，获得高活性目标产品。用作医药、食品和化妆品的生物产物与人类生命息息相关。因此，要求分离纯化过程必须去除原料液中含有的热源及具有免疫原型的异体蛋白质等有害人类健康的物质，并且防止这些物质在分离操作过程中从外界混入。原料液中常存在与目标分子在结构、构成成分等理化性质上极其相似的分子及异构体，形成用常法难于分离的混合物，因此，一般需要利用具有高度选择性的分子识别技术或高效液相色谱技术纯化目标产物。同时，生物产物的原料构成成分复杂，需要采用多种分离技术和分离步骤完成一个目标产物的分离纯化任务。原料液中目标产物的浓度一般很低，有时甚至是极微量的，因此，往往需要从庞大体积的原料液中分离纯化目标产物，即需要对原料液进行高度浓缩。,生物分离工程,生物分离的本质：有效地识别混合物中不同溶质间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质和（或）扩大这些差别的分离设备实现溶质间的分离或目标组分的纯化。分离技术：平衡分离基于相间分配平衡差异差速分离外力作用下产生的溶质移动速度差别,分离方法和设备的评价指标分离容量分离速度分辨率分离过程和产品的评价指标浓缩率产品的浓缩程度分离因子产品的分离纯化程度回收率产品的回收比例,细胞分离与破碎,重力沉降是利用流体与颗粒间的密度差，在重力的作用下使颗粒与流体之间产生相对运动，从而实现两者的分离。Stokes公式,提高重力沉降的途径：加入中性盐双电层排斥电位较低，有利于凝聚加入高分子絮凝剂（聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺）架桥作用形成大凝聚颗粒引入外力,细胞分离与破碎,离心分离方法（相对分子质量越大，沉降系数越大）1.差速离心分级差速离心是应用某一特定颗粒沉淀的离心力在预定的离心时间内得到一部分颗粒沉淀及包含为沉淀颗粒的上清液。2.区带离心差速区带离心平衡区带离心,梯度液：蔗糖氯化铯核酸溴化钠脂蛋白,细胞分离与破碎,过滤：利用薄片形多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。推动力：以压力差为主要推动力阻力：多孔性过滤介质和介质表面不断堆积形成的滤饼（主要）提高过滤速度的方法：对滤液进行絮凝或凝聚等预处理，改变料液的性质，降低滤饼阻力在料液中加入助滤剂以改变滤饼的压缩性指数，提高过滤速度以菌体细胞的收集为目的时，使用助滤剂会给以后的分离纯化操作带来麻烦，故需谨慎。,细胞分离与破碎,破碎细胞的目的：使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物。,细胞分离与破碎,初级分离,初级分离：从发酵液、细胞培养液、胞内提取液及其他各种生物原料初步提取目标产物，是目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。特点：分离对象体积大、杂质含量高分离技术低操作成本、适于大规模生产,沉淀：物理环境的变化引起溶质溶解度的降低、生成固体凝聚物的现象。沉淀与结晶的区别：沉淀生成的固体颗粒是不定形的结晶产品为单一组分，而沉淀凝聚物则成分非常复杂（含杂质、溶剂等）沉淀的纯度远远低于结晶多不沉淀操作也可获得高纯度的目标产品,初级分离,蛋白质的表面特性：蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区构成。“双重屏障”蛋白质分子周围的水化层蛋白质分子间的静电排斥作用由电位决定。电位越大，蛋白质溶液越稳定。双电层：紧密层分散层蛋白质沉淀策略：破坏蛋白质周围的水化层降低静电排斥作用（双电层厚度）,初级分离,盐析蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象。盐溶向蛋白质的水溶液逐渐加入电解质时，开始阶段蛋白质的活度系数降低，并且蛋白质吸附盐离子后，带电表层使蛋白质分子间相互排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却加强，因而蛋白质的溶解度增大。Cohn方程,S-蛋白质溶解度，g/LKs-盐析常数I-离子强度，mol/L,影响盐析的因素无机盐种类和浓度影响Ks盐的种类对蛋白质溶解度的影响与离子的感胶离子序列相符；离子半径小而带电荷较多的阴离子的盐析效果较好，硫酸铵最常用。温度和pH影响在低离子强度溶液中，蛋白质的溶解度在一定的温度范围内随着温度的升高而增大；在高离子强度溶液中，温度的升高有利于蛋白质脱水，破坏水化层并导致蛋白质的溶解度降低；在pH值结晶蛋白质等电点的溶液中，蛋白质的溶解度最小（值最小）。,初级分离,盐析沉淀操作：无机盐的选择依据沉淀剂（无机盐）的性质溶解度曲线的绘制以饱和度为横坐标，上清液中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标,等电点沉淀：利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法。原理（或实现）：利用在低离子强度下蛋白质溶解度较低的特性，调整溶液pH值至等电点或在等电点的pH下利用透析等方法降低离子强度，使蛋白质沉淀。等电点沉淀的操作条件低离子强度,初级分离,等电点沉淀特点：等电点沉淀在较低的离子强度下进行，因此沉淀操作结束后无需脱盐与其他沉淀结合使用溶液的pH值调节方便，但过低的蛋白质等电点容易引起目标蛋白质变性,有机溶剂沉淀原理：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，水的活度降低。随着有机溶剂浓度的增大，蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而凝聚和沉淀。有机溶剂的选择：必须与水完全互溶且不与蛋白质发生相互作用必须考虑溶剂使用的安全性特点：优点：有机溶剂密度较低，易于沉淀分离；与盐析沉淀相比，沉淀产物不需脱盐,缺点：有机溶剂沉淀容易引起蛋白质变性，因此有机溶剂沉淀必须在低温下进行；通常温度应低于10。,初级分离,热沉淀原理：在较高的温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而发生凝聚和沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，以分离出热稳定性高的目标蛋白产物。（与热力学沉淀方法不同，热沉淀过程是基于蛋白质的变性动力学）,其他沉淀法：1.聚合物沉淀非离子型聚合物沉淀原理：降低蛋白质的水化度，增大蛋白质间的静电引力而使蛋白质沉淀；聚电解质沉淀原理：与絮凝作用类似，是在蛋白质间起架桥作用。2.重金属盐沉淀蛋白质优点：可使浓度很低的蛋白质沉淀，沉淀产物中的重金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。3.生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质,初级分离,泡沫分离：根据表面吸附原理，利用通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体对液相中的溶质或颗粒进行分离的方法。原理：向水中加入表面活性剂，水溶液的表面张力随表面活性剂浓度的增大而下降。当表面活性剂浓度达到一定值后，将发生表面活性剂分子的缔合或自聚集，形成水溶性胶团。形成胶团后，溶液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。临界胶团浓度（CMC）表面活性剂在水溶液中形成胶团的最低浓度。泡沫分离一般在CMC以下进行。表面活性剂分子由亲水的极性头和疏水的非极性尾构成。在气液界面处，极性头溶于水相，而非极性尾暴露在气相中（气泡内）。,初级分离,泡沫的形成：向含有表面活性物质的溶液鼓气，或快速搅拌含有表面活性物质的溶液，溶液中会形成大量气泡。由于表面活性剂在气液界面发生吸附，气液界面张力（表面能）较低，生成的气泡相对稳定。气泡在浮力作用下上升，在液相表面大量的气泡汇聚成泡沫。泡沫的结构（泡沫排液的原理）三泡结构中，每两个气泡之间形成平面的间壁，三个气泡的共同交界处使具有一定曲率半径的小三角柱。由于该交界具有内凹的表面，该点的压力低于两泡交界的平面。因此，在气泡界面上存在压力梯度，使泡间液膜中的液体向三泡交界的小三角柱中流动，引起平面液膜变薄。泡沫的消灭泡沫中液体的流失使液膜变薄，导致气泡破裂。泡沫集团中小气泡的内压高于大气泡，因此，小气泡中的气体会通过液膜向与其相邻的大气泡中扩散，导致大气泡更大，小气泡更小，直至消失。优势：泡沫分离设备简单，易于放大；操作简便，能耗低；可连续和间歇操作；在生物下游加工过程的初期使用，处理体积庞大的稀料液；可直接用于处理含有细胞或细胞碎片的料液；只要操作条件设计合理，可获得很高的分离效率。,膜分离,膜分离：利用具有一定选择性透过特性的过滤介质进行物质分离纯化的方法。分离过程中膜的功能：物质的识别与透过使混合物中各组分之间实现分离的内在因素；相界面将透过液和保留液（料液）分为互不混合的两相；反应场膜表面及膜孔内表面含有与特定溶质具有相互作用能力的官能团，通过物理作用、化学反应或生化反应提高膜分离的选择性和分离速度。,膜分离,渗透若纯水与含有溶质的水溶液被一张可透过溶剂，但不能透过溶质的膜隔开。在浓度差作用下作为溶剂的水分子从溶质浓度低的一侧向溶质浓度高的一侧透过，这种现象称为渗透。反渗透在外加压力驱动下借助半透膜的选择截流作用，溶剂由高浓度溶液透过半透膜向低浓度渗透。超滤UF根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间分子量的差别进行分离的方法。微滤MF一种从悬浮液中分离固形成分的方法，是根据料液中的固形成分与溶液溶质在尺寸上的差异进行分离的方法。透析利用具有一定孔径大小、高分子溶质不能透过的亲水膜将含有高分子溶质和其他小分子溶质的溶液与纯水或缓冲液（透析液）分隔。由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓差的作用下，高分子溶液中的小分子溶质透向透析液，透析液中的水则透向高分子溶液。电渗析利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法。渗透汽化（原理）疏水膜的一侧通入料液，另一侧（透过侧）抽真空或通入惰性气体，使膜两侧产生溶质分压差。在分压差作用下，料液中溶质溶于膜内，扩散通过膜，在透过侧发生汽化，汽化的溶质被膜装置外设置的冷凝器冷凝回收。因此，渗透汽化法根据溶质间透过膜的速度不同，使混合物得到分离。,膜分离,常用膜材料：天然高分子材料合成高分子材料无机材料膜材料的要求起过滤作用的有效膜厚度小，超滤和微滤膜的开孔率高，过滤阻力小；膜材料为惰性，不吸附溶质；使用的pH和温度范围广，耐高温、酸碱等，稳定性好；容易通过清洗恢复透过性能；满足实现分离目的的要求。对称膜：膜截留的膜厚方向上孔道分布均匀。对称膜的传质阻力大，透过通量低，并且容易污染，清洗困难。不对称膜：起膜分离作用的表面活性层表面活性层很薄，孔径微细，透过通量大，孔膜不易堵塞，易清洗；起支撑强化作用的惰性层惰性层孔径较大，对流体透过无阻力。,膜分离,膜的孔道特性：包括孔径、孔径分布和孔隙率。最大孔径可通过泡点法测量，即在膜表面覆盖一层水，用水湿润膜孔，从下面通入空气，当压力升高到有稳定气泡冒出时称为泡点，此时的压力称为泡点压力。,水通量：膜材料的纯水透过通量，其是在一定条件下（0.1MPa，温度为20）通过测量一定纯水所需的时间测定。影响因素：水通量随着膜截留分子量或膜孔径的增大而增大；膜材料的种类对水通量的影响显著。,膜组件：管式膜组件平板式膜组件螺旋卷式膜组件中空纤维（毛细管）式膜组件,膜分离,浓度极化：由于溶质受到膜的截留作用而在膜表面附近浓度高于主体浓度的现象。（膜表面附近浓度升高，增大了膜两侧的渗透压差，使有效压差减小，透过通量降低。）凝胶极化：当膜表面附近的浓度超过溶质的溶解度时，溶质会析出，形成凝胶层的现象。截留率：表示膜对溶质的截留能力，可用小数或百分数表示。实际分离过程中的真实截留率为,截留曲线：通过测定相对分子质量不同的球形蛋白质或水溶性聚合物的截留率，可获得膜的截留率与溶质相对分子量之间关系的曲线。（理想情况下，超滤膜的截留曲线应为过横坐标MMCO的一条垂直线。孔径分布范围较小，则截留曲线较陡直；反之则平缓）一般将截留曲线上截留率为90%的溶质的相对分子质量定义为膜的截留相对分子质量，MMCO,膜分离,影响截留率的因素：分子特性相对分子量相同的溶质，呈线状的分子截留率较低，有支链的分子截留率较高，球形分子截留率最大；对于荷电膜，具有与膜相反电荷的分子截留率较低，反之则较高；若膜对溶质具有吸附作用，溶质的截留率增大。其他高分子溶质的影响当两种以上的高分子溶质共存时，会出现某种溶质的截留率高于其单独存在下截留率的情况。操作条件温度升高，黏度下降，截留率降低；膜表面流速增大，则浓度极化现象减轻，截留率减小；当料液的pH等于其中含有的蛋白质的等电点时，由于蛋白质的净电荷为零，蛋白质间静电斥力最小，蛋白质在膜表面形成的凝胶极化层浓度最大，透过阻力最大。此时，溶质的截留率高于其他pH值下的截留率。,膜分离,影响膜分离速度的主要因素：操作形式终端过滤：料液流向与膜面垂直，膜表面滤饼阻力大，透过通量很低错流过滤：料液流向与膜面平行，流动的剪切作用可大大减轻浓度极化现象或凝胶层厚度，是透过通量维持在较高水平。流速流速对透过通量的影响主要反映在对传质系数上。传质系数随流速的增大而提高，因此，流速增大，透过通量亦增大。实际理论压力当压力较小时，膜面上尚未形成浓度极化层，Jv（透过通量）与p成正比；当p逐渐增大时，膜表面出现浓度极化现象，Jv的增长速率减慢；当p继续增大，出现凝胶层时，由于凝胶层厚度随压力增大而增大，所以Jv不再随p增大，此时的Jv为此流速下的极限值。料液浓度当料液中含有多种蛋白质时，由于与单组分时相比，总蛋白质浓度升高，因此透过通量下降；由于其他蛋白质的共存使蛋白质的截留率上升，透过通量下降。,膜分离,膜污染的原因：凝胶极化引起的凝胶层，阻力为Rg溶质在膜表面的吸附层，阻力为Ras膜孔堵塞，阻力为Rp膜孔内的溶质吸附，阻力为Rap膜清洗策略：清洗一般选择水。对蛋白质的严重吸附引起的膜污染，用蛋白酶溶液清洗。中空纤维膜的清洗方法：反洗对于内压式中空纤维膜组件，清洗液从壳方通入，与正常膜分离操作时的透过方法相反；反洗操作中清洗液从膜孔较大的一侧透向膜孔较小的一侧，可除去堵塞膜孔的微粒；适合于回收高价蛋白质产物。循环清洗将透过液出口密封，可进行循环清洗；可使通量恢复到原通量的90%以上；适合于处理含细胞或固体颗粒的料液。,萃取,萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。萃取的基本原理：萃取操作中至少有一相为流体，称其为萃取剂。萃取剂的加入引起两相分层，形成互不相溶的两个液相，两相之间以一界面接触。在相间浓度差的作用下，料液中的溶质向萃取相扩散，溶质浓度不断降低，而萃取相中溶质浓度不断升高。溶质浓度随时间变化速率（萃取速率）：达到分配平衡时，萃取速率为零，各相中的溶质浓度不再变化。溶质在两相中的分配平衡是状态函数，与萃取操作形式无关。,超临界萃取,液固萃取（浸取）,液液萃取,固体液体,有机溶剂萃取双水相萃取液膜萃取反胶团萃取,原料,萃取,物理萃取：溶质根据相似相溶原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。（抗生素及天然植物中有效成分的提取）化学萃取：利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。（氨基酸、抗生素和有机酸等生物产物的分离回收）分配定律：（只在较低浓度范围成立）溶质在两相中的分配平衡规律，即在恒温恒压条件下，溶质在互不相溶的两相中达到分配平衡时，如果其在两相中的平衡浓度之比为常数，称为分配常数。分配系数：溶质在两相中的总浓度之比，其用于表示溶质的分配平衡关系。,或,萃取,溶剂萃取操作：水相物理条件的影响物理萃取时，弱酸性电解质的分配系数随pH值降低而增大，弱碱性电解质正相反；通过调节水相的pH值控制溶质的分配行为，从而提高萃取率的方法广泛应用于抗生素和有机酸等弱电解质的萃取操作；反萃取操作同样可通过调节pH值来实现；选择适当的操作温度，有利于目标产物的回收和纯化；无机盐的存在可降低溶质在水相中的溶解度，有利于溶质向有机相中分配。有机溶剂或稀释剂的选择依据廉价易得；与水相不互溶；与水相有较大的密度差，且黏度较小，表面张力适中，有利于相分散和相分离；容易回收和再利用；毒性、腐蚀性小，闪点低，使用安全；不与目标产物发生反应。,萃取,化学萃取剂可用于抗生素的化学萃取剂有长链脂肪酸、羟基磺酸、三氯乙酸、四丁胺和正十二庚胺。乳化现象乳化是水或有机溶剂以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象。产生乳化的主要原因：发酵液中存在的蛋白质和固体颗粒等物质，这些物质具有表面活性剂的作用，使有机溶剂（油）和水的表面张力降低，油或水易于以微小液滴的形式分散于水相或油相中。防止乳化：在实施萃取操作前，对发酵液进行过滤或絮凝沉淀处理，可除去大部分蛋白质及固体微粒，防止乳化现象的发生。,萃取,聚合物的不相容性：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。常见的双水相系统：双聚合物体系：聚乙二醇/葡聚糖（PEG/Dx）单聚合物体系：聚乙二醇/磷酸钾体系（PEG/KPi）双水相系统相图：双结点线（曲线）以下为均相区，以上为两相区；系线（连接双结点线上两点的直线）在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。临界点当系线长度趋近于零时，两线差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1。,萃取,静电作用道南电位实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解质，当这些离子在两相中分配浓度不同时（即分配系数不为1），在两相间产生的电位差。分配系数：荷电溶质的分配系数的对数（lnm）与溶质的净电荷数（Z）成正比；双水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同，故分配系数亦发生改变。疏水作用PEG/Dx或PEG/无机盐构成的双水相体系中PEG相的疏水性较大。疏水性因子（HF）就是两相间疏水性差异的表现。疏水性因子HF测量通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数maa。RH氨基酸的相对疏水性蛋白质的表面疏水性（HFS）蛋白质的表面疏水性HFS随着无机盐浓度的增大而增大。,萃取,尺寸效应（表面能）从热力学的角度分析，蛋白质在两相间的分配是由能量所决定的。当蛋白质在某相中能量较低的时候，其就比较集中地分布在该相中。影响分配系数的因素成相聚合物和浓度降低聚合物的相对分子质量，蛋白质易分配于富含该聚合物的相中。例，PEG/Dx系统的上相富含PEG，若降低PEG的相对分子质量，则分配系数增大；若降低葡聚糖的相对分子质量，则分配系数减小。当成相系统的总浓度增大时，系统远离临界点，系线长度增加，两相性质的差别增大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值（m=1）盐的种类和浓度主要反映在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。当盐的浓度很大时，由于强烈的盐析作用，蛋白质的溶解度达到极限，表观分配系数增大，此时分配系数与蛋白质浓度有关。pH值交错分配法（蛋白质等电点测定）通过测定不同盐类存在下分配系数随pH值的关系曲线的交点，可测定蛋白质、细胞器及微粒的等电点。温度温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。,萃取,双水相系统的选择：根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷等性质上的差别，综合利用静电作用、疏水作用和添加适当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物。,液膜萃取：由水溶液或有机溶剂构成的液体薄膜将与之不互溶的液体分隔开来，使其中一侧液体中的溶质选择性地透过液膜进入另一侧，从而实现溶质间的分离。液膜的种类：1.乳状液膜膜溶剂含量占90%以上；表面活性剂起稳定液膜的作用，是乳状液膜的必需成分；添加剂促进溶质跨膜输送的流动载体。2.支撑液膜将多孔高分子固体膜浸在膜溶剂中，使膜溶剂充满膜的空隙形成的液膜。主要部件为多孔膜，常用的有聚乙烯。聚四氟乙烯等高疏水性膜。3.流动液膜也是一种支撑液膜，弥补了上述支撑液膜的膜相容易流失的缺点。,萃取,液膜萃取机理：单纯迁移根据料液中各种溶质在膜相中的溶解度（分配系数）和扩散系数的不同进行的萃取分离。反萃相化学反应促进迁移在处理有机酸等弱酸性电解质的分离纯化方面，可利用强碱（如氢氧化钠）溶液为反萃相。反萃相中含有氢氧化钠，与料液中溶质（有机酸）发生不可逆化学反应生成不溶于膜相的盐。在膜相的传质速率为控制步骤，也就是说氢氧化钠与酸的反应速率很快时，反萃相中有机酸的浓度接近于零，使膜相两侧保持最大浓差，促进有机酸的迁移，直到氢氧化钠反应完全。这种利用反萃相内化学反应的促进迁移又称为I型促进迁移。溶质在反萃相得到浓缩，萃取速率快。膜相载体输送利用膜相中流动载体选择性输送作用的传质机理称为载体输送，又称为型促进迁移。分为反向迁移（供能物质与目标溶质迁移方向相反，例如氨基酸及有机酸的载体输送）和同向迁移（例如钾离子的载体输送）。,萃取,膜相组成：1.膜溶剂膜溶剂的黏度是影响乳状液膜稳定性、液膜厚度和传质性能的重要参数。当膜溶剂的黏度较小时，液膜厚度减小，传质系数增大，但液膜不够稳定，在操作中易破损，影响分离效果。2.表面活性剂表面活性剂对乳状液膜的稳定作用在于其可明显改变相界面的表面张力，但不是所有表面活性剂都可用于液膜的配置。表面活性剂能否促进稳定的乳状液膜的形成主要取决于亲水亲油（HLB）值。乳状液膜中的表面活性剂不仅对液膜的稳定性起决定性的作用，而且对液膜的渗透性有显著影响。随着表面活性剂浓度的增大，液膜的稳定性提高，有利于液膜萃取效果的改善。3.流动载体主要作用是促进迁移，仅溶于液膜相，并且对目标分子由特异性输送作用，常用的有季铵盐、胺类、磷酸酯类和冠醚类。,萃取,化学破乳：向乳化液中加入极性破乳剂，吸附乳化液中的表面活性剂，从而降低乳化液的稳定性，实现破乳的目的。（适用范围有限，对系统产生污染）静电破乳：利用高压电场的作用使乳液滴带电，在电场中产生泳动。在交变电场中乳滴的泳动使其受到不同方向的剪切作用而被破坏。（操作方便，效果好）影响液膜萃取的操作参数：161、pH值对氨基酸和有机酸等弱电解质溶质，料液的pH值直接影响其荷电形式及不同电荷形式的溶质所占的比例，从而影响萃取率。2、流速利用支撑液膜萃取，料液的流速对液固表面传质系数有直接影响，从而影响萃取速率。搅拌速率影响乳状液膜稳定性。,萃取,3、共存杂质利用选择性较低的离子交换萃取剂为流动载体，料液中存在的与目标产物带相同电荷的杂质时，由于杂质与载体的竞争性反应，减小了用于目标产物和供能离子输送的载体量，从而引起目标分子透过通量降低。4、反萃相对于反萃相化学反应促进迁移和膜相流动载体促进迁移的萃取过程，反萃相的组成和浓度影响萃取速率和选择性。利用碳酸钠溶液为内水相的乳状液膜萃取青霉素时，青霉素的平衡萃取率随碳酸钠浓度升高而增大。萃取率随外水相中柠檬酸浓度的升高而增大。降低pH值。5、操作温度提高操作温度，溶质的扩散系数增大，有利于萃取速率的提高。高温下，液膜黏度降低，膜相挥发速度增快，甚至造成表面活性剂的水解，不利于液膜位点。6、萃取操作时间,萃取,临界胶团浓度表面活性剂在水溶液中形成胶团的最小浓度。反胶团表面活性剂在有机溶剂中形成的胶团。反胶团萃取：利用表面活性剂在有机相中形成的反胶团，从而在有机相内形成分散的亲水微环境，使生物分子在有机相（萃取相）内存在于反胶团的亲水微环境,消除了生物分子，特别是蛋白质类生物活性物质难于溶解在有机相中或在有机相中发生不可逆变性的现象。反胶团的溶解作用：131.静电相互作用当蛋白质所带电荷与表面活性剂极性头电荷相反时，蛋白质与表面活性剂发生静电引力作用，蛋白质易于进入有机相，分配系数较大；反之较小；蛋白质与表面活性剂极性头之间强烈的静电作用往往引起萃取过程中蛋白质变性；静电相互作用也反映在盐浓度的影响上，随着无机盐浓度的增加，微水池内双电层厚度降低，静电作用减弱，蛋白质溶解度改变。,萃取,2.空间相互作用随着盐浓度的增加反胶团相发生脱水作用，导致反胶团的含水率随无机盐浓度的增加而降低，引起反胶团直径的减小，空间排阻作用增大，蛋白质进入反胶团困难，蛋白质溶解率降低在蛋白质的等电点处，随着蛋白质分子量的增大，其在同一反胶团体系中的溶解率降低；蛋白质直径大于微水池直径时，蛋白质难以溶解。3.疏水性相互作用氨基酸或寡肽的分配系数随着氨基酸疏水性的增大而增大。疏水性相互作用对蛋白质的反胶团萃取也有重要影响。蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式，从而影响到蛋白质的分配系数。蛋白质的溶解方式：液液接触法注入法溶解法,影响分配平衡的因素：有机相助溶剂表面活性剂和助表面活性剂盐的种类综合考察,萃取,临界点物质均具有其固有的临界温度和临界压力，在压力-温度相图上称为临界点。超临界流体在临界点以上的物质处于既非液体也非气体的超临界状态，称为超临界流体。CO2是常用的超临界流体萃取剂。超临界流体性质：在临界点附近的超临界状态下等温线的斜度平缓，即温度或压力的微小变化就会引起密度发生很大变化。随压力升高，超临界流体密度增大，接近液体的密度，因此具有与液体相近的溶解能力由于超临界流体黏度小、自扩散系数大，可以迅速渗透到物体的内部溶解目标物质，快速达到萃取平衡。粘度接近于气体，因粘度低，输送时所須的功率则较液体低密度接近于液体，密度随压力增大而增大；因密度高，可输送较气体更多的超临界流体；具有与液体相近的溶解能力；扩散系数高于液体10至100倍，亦即质量传递阻力远小于液体，因此在质量传递上较液体快；超临界流体有如气体几无表面张力，因此很容易渗入到多孔性组织中。,吸附分离,吸附吸附是溶质从液相或气相转移到固相的现象，即利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面。物理吸附：基于吸附剂与溶质间范德华力，无选择性、无需高活化能、吸附层可以是单层，也可以是多层、吸附和解吸附速度通常较快；溶质在吸附机上吸附与否或吸附量的多少取决于溶质与吸附剂极性的相似性和溶剂的极性；吸附发生在吸附剂的整个自由表面，被吸附的溶质可通过改变温度、pH值和盐浓度等洗脱。化学吸附：基于吸附剂与溶质之间的化学结合，吸附过程产生电子转移；需要高活化能、化学吸附为单分子层吸附，吸附稳定，不易脱附，故脱附化学吸附质一般采用破坏化学键合的化学试剂；选择性强、吸附和解吸附速度较慢；离子交换：基于吸附剂与溶质之间的静电引力，吸附过程发生电荷转移以离子交换剂为吸附剂通过离子交换剂表面键合的离子基团或可离子化基团，吸附带有相反电荷的离子吸附质一般通过提高离子强度或调解pH值的方法洗脱,吸附分离,吸附剂分类：多孔型吸附剂介质凝胶型吸附剂介质评价吸附性能的参数：比表面积一般采用B.E.T法测定直接影响到溶质的吸附容量，较大的比表面积可使溶质的吸附量增加。孔径压汞法主要体现在对溶质在吸附剂内扩散的影响方面。孔径越大，溶质分子扩散越容易，反之则越困难。孔径和比表面积相互制约，孔径越大，比表面积越小,吸附分离,生物小分子的回收种类：苯乙烯-二乙烯基苯型，丙烯酸-二乙烯苯型，多乙烯多胺-环氧氯丙烷型树脂特点：疏水性高、交联度大、孔隙率小及电荷密度高生物大分子的回收种类：葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶，醋酸纤维素凝胶：特点：亲水性好、非特异性吸附小,吸附分离,离子交换剂性能的评价交换容量单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数。吸附容量是表征离子交换能力的主要参数交换容量的测定阳离子交换剂转化为氢型阴离子交换剂转化为氯型滴定曲线检验和测定离子交换剂性能的重要数据滴定曲线表示交换容量随pH值的变化。因此，滴定曲线比较全面地表征了离子交换剂的性质。吸附等温线当温度一定时，吸附剂上的平衡吸附质浓度q与液相游离溶质浓度c之间的函数关系称为吸附等温线。低浓度下高浓度下langmuir方程,吸附分离,兰格缪尔吸附理论要点：吸附剂表面有许多活性点每个活性具有相同的能量，只能吸附一个分子吸附的分子间物相互作用兰格缪尔参数分析：当吸附剂对溶质的吸附作用非常强烈时，Langmuir吸附解离常数Kd非常小，此时溶液溶质浓度对吸附浓度的影响很小，接近不可逆吸附，吸附等温线则为矩形,吸附分离,空间质量作用模型（SMA）参数的意义：特征电荷z描述平均一个蛋白质分子结合的离子交换基团数量平衡常数K表示蛋白质与离子交换剂表面相互作用的强弱空间因子一个蛋白质分子所屏蔽的反离子数,固相扩散模型：孔扩散模型以孔内游离溶质浓度梯度为扩散传质的推动力表面扩散模型在吸附剂内任意位置处，游离溶质和吸附溶质处于平衡状态；均相扩散模型将吸附剂粒子看做具有均相网络结构的粒子，传质推动力为吸附剂内部所有溶质的浓度差。平行扩散模型孔扩散和表面扩散对于溶质的固相传质同等重要固定床吸附穿透曲线吸附过程中吸附塔出口溶质浓度的变化曲线穿透点抽扣除溶质浓度开始上升的点穿透时间达到穿透点所用的操作时间（由于穿透点难于准确测定，故一般将出口浓度达到入口浓度5%10%的时间称为穿透时间）,吸附分离,恒定图式分布在吸附塔中，吸附带的浓度分布（浓度波）以一定的形状移动。只有在优惠吸附（吸附等温线上凸）时才可能发生多级吸附操作：多柱串联操作属于半连续操作；多柱串联使整个系统中的流体流动更接近平推流，有利于提高吸附效率。膨胀床液固相返混程度较低的液固流化床。膨胀床兼具固定床和流化床的优点。与流化床相比膨胀床内流化的固相介质基本可以悬浮在膨胀床内的固定位置，流化流动状态和固定床相近，以接近平推流的方式流经床层，所以液固两相的轴向混合程度都较低，从而使目标产物获得良好的吸附效率。与固定床相比膨胀床吸附可直接处理菌体发酵液或细胞匀浆液，回收其中的目标产物，从而可节省离心或过滤等预处理过程，提高目标产物收率，降低分离纯化过程成本。,色谱,色谱根据混合物中的溶质在互不混溶的两相间分配行为的差别引起的随流动相移动速度的不同进行分离的方法。色谱原理：色谱操作中互不混溶的两相分别称为固定相和流动相。固定相填充于柱内形成固定床，在柱的入口端加入料液后，连续输入流动相，料液中溶质在流动相与固定相之间扩散传质，产生分配平衡。分配系数大的溶质在固定相上存在的概率大，随流动相移动的速度小；分配系数小的溶质则相反溶质之间由于移动速度的不同而得到分离。,色谱,色谱,平衡模型模型假设整个层析柱中不存在传质阻力，分配平衡瞬间完成流动相的流动为平推流模型特点：平衡模型形式简单，但信息量少，可用于解释一些基本色谱现象拖尾现象优惠吸附中：洗脱时间短吐舌现象非优惠吸附中：洗脱时间短,色谱,理论板模型模型假设溶质的分配平衡不能瞬间完成，需要一定的柱高。理论板模型特点仅用一个理论板数或HETP描述层析柱分离性能，使用方便；适用于低料液浓度的色谱过程无法确定影响分离性能的因素传质速率模型,轴向扩散系数Dz,轴向分子扩散,流速的不均匀现象,与u无关,与udp成正比,分离度又称分辨率，是表达两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。表达容量因子容量因子是固定相与流动相间溶质分配量之比，用k表示选择性选择性为洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比,色谱,凝胶过滤色谱（SEC）凝胶过滤色谱利用凝胶粒子为固定相，是根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离的液相色谱法。凝胶过滤色谱原理色谱柱中装填具有一定孔径分布的凝胶过滤介质在SEC柱中，分子量大的溶质不能进入凝胶介质，而沿介质空隙流过V0分子量很小的溶质能够进入所有的细孔中，其洗脱体积接近柱体积Vt分子两介于两者之间的溶质能够进入部分细孔中V凝胶过滤色谱的分配系数可用下式表示GFC的分配系数在01之间，分离精度有限。影响分配系数的因素相对分子量相对分子量一定的溶质的m值为常数，为凝胶介质对该溶质的有效孔隙率p；分配系数随相对分子量的增加而降低；分子形状凝胶结构,色谱,常用的凝胶过滤介质葡聚糖凝胶介质葡聚糖（右旋糖酐）与环氧氯丙烷合成琼脂糖凝胶介质琼脂糖与环氧氯丙烷合成其他亲水性高分子合成的凝胶介质多种多糖制备的凝胶介质,凝胶过滤色谱应用分离纯化脱盐相对分子量测定,色谱,凝胶特性参数排阻极限不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量分级范围能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量范围溶胀率介质溶胀后每千克干凝胶所吸收的水分的百分数空隙体积色谱柱内凝胶之间空隙的体积，可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。凝胶粒径床体积针对以干燥状态购入的凝胶粉末而言。凝胶干粉的床体积是指1g干胶粉末充分溶胀后所占有的体积。,色谱,影响分离特性的因素线速度h=A+Bv料液体积在一定料液体积范围HETP（等板高度）为常数，之后HETP随着料液体积增大而急剧增大料液体积需根据溶质之间分配系数的差别控制在适当范围内，一般为不超过柱体积的10%料液浓度料液浓度过高会导致料液区与流动相间粘度差增大，从而出现吐舌或拖尾，甚至分裂为两个峰，使HETP急剧增大分子量与分配系数关系在溶质的分配系数在分级范围内随相对分子质量的对数值增大而线性减小凝胶的分级范围越小，分离度越大凝胶粒径凝胶粒径越小，HETP越小减小粒径，柱效增大，分离度提高，分离速度提高,色谱,凝胶过滤色谱特点：优点溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率接近100%；分离结束后无需苛刻的介质清洗或再生，循环操作易实现，提高了产品纯度；作为脱盐手段，SEC比透析法速度快、精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白活性收率高；分离机理简单，操作参数小，规模放大容易；缺点仅根据溶质间相对分子质量的差异进行分离，选择性低，料液处理量小，一般为柱体积的5%；经SEC洗脱展开后产品被稀释，因此需要在其它浓缩作用的单元操作后使用；,色谱,离子交换色谱离子交换色谱利用离子交换剂为固定相，是根据荷电溶质与离子交换剂之间的静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法溶质在离子交换剂上的分配系数可表示为其中m为离子强度无限大时溶质的分配系数，表明对除静电作用以外其他作用的贡献。分配系数对离子强度（I）很敏感，I微小的变化都会引起分配系数的改变；不同蛋白质B值相差很大,色谱,线形洗脱法（lineargradientelution)流动相的离子强度线性增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大特点难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱；改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积；流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作范围广；需要特殊调配浓度梯度的设备分离度当离子强度梯度一定时，分离度与柱高无关当柱高一定时，分离度随离子强度梯度的降低而增大分离度与成反比,色谱,阶跃梯度洗脱法（逐次洗脱法）（Stepwiseelution）流动相的离子强度阶跃增大，溶质的分配系数的降低和移动速度的增大也是阶段式的。特点当阶跃速度很快，则其接近线性梯度洗脱；反之，则接近恒定洗脱；利用切换不同盐浓度的流动相进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便；流动相浓度不连续变化，易出干扰峰；易出现多组分洗脱峰重叠现象；离子交换色谱特点料液处理量大，具有浓缩作用；应用范围广泛，通过优化条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长短；吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高；离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和吸附剂；影响分离特性因素复杂；,色谱,疏水性相互作用色谱疏水性相互作用色谱利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱法。原理：组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基团，如苯丙氨酸，酪氨酸；这些基团大部分处于蛋白质内部，但有部分疏水基团暴露于蛋白质表面；在高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏，更多的疏水部分暴露在外这些暴露在外的疏水基团与介质上的弱疏水性配基发生疏水性作用，被固定相吸附蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相盐析盐浓度的提高而增大HIC采用高盐下吸附，低盐下洗脱,色谱,常用配基苯基、短链烷基、烷氨基、聚乙二醇聚醚修饰密度疏水配基修饰密度一般在1040umol/ml疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基目的成正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性而异。特点在高盐浓度下疏水作用较大，HIC可直接分离盐析后蛋白质溶液可通过调节疏水性配基链长和密度调节HIC的吸附力吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当与IEC的机理完全不同，可与HIC互补,色谱,色谱聚焦基于离子交换原理，根据两性电解质分子间等电点的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。固定相：在较宽pH范围内具有缓冲作用的多缓冲离子交换剂流动相：以在较宽pH范围内具有缓冲作用的多缓冲液反相色谱利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差别进行分离纯化的洗脱层析法与HIC的异同反相层析中溶质亦通过疏水性作用分配于固定相表面；反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性；必须采用极性有机溶剂或其水溶液进行洗脱分配系数溶质在反相色谱中分配系数取决于溶质的疏水性，疏水性越大，分配系数越大；当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数；流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，因此反相层析多采用降低流动相极性的线性梯度洗脱法,色谱,影响疏水性吸附的因素离子强度及种类蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大；离子的种类也对蛋白质疏水性吸附有着重要影响破坏水化作用的物质离子半径大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子间相互作用，具有破坏水化作用的性质（离液离子）离液离子存在下疏水性作用减弱；乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降低蛋白疏水性吸附作用，作为洗脱促进剂；表面活性剂表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。温度一般吸附为放热过程，而疏水性吸附的结合作用随温度升高而增大吸热过程,色谱,流通色谱流通色谱指利用含有对流孔的介质为固定相的液相色谱法。介质结构穿透孔孔径在0.60.8um,孔内流动为对流形式；扩散孔孔径在50100nm,孔内传质为扩散传质；介质制备POROS流通色谱介质该制备方法是首先合成微球，然后通过聚集形成聚集体，最终经聚集体的再聚合形成所需粒径的分离介质联合致孔法通过固、液联合致孔方法合成双分散孔型层析介质，该方法适用范围广，合成方法简单；连续床色谱介质以色谱柱为模具，在柱内原位合成多孔型聚合物单块，再经适当的功能基化可用于分离特点流通色谱介质穿透孔之间以扩散孔相连，保证了介质大的比表面积和溶质吸附量扩散孔长度大大缩短，降低了扩散传质阻力；色谱操作线速度大于500cm/h,色谱,连续床优点连续床在柱内原位合成制备，避免了传统的颗粒填充床颗粒制备和层析柱的填充过程；连续床介质在层析柱内为多孔型连续相，孔径在亚微米及微米级之间，在中、低压力下液体可高速通过连续床孔隙，两相间发生对流传质；连续床介质为连续相，内部孔隙率可达0.8以上，提高了层析柱的有效利用空间。置换色谱原理置换色谱基于置换剂与吸附质间在吸附剂表面的竞争性吸附；上扬前，先用适合于溶质吸附的流动相平衡载液平衡的层析柱添加一定量料液，料液中溶质吸附于入口处。连续输入含有置换剂的溶液，置换剂与固定相表面结合位点的亲和力比料液中的各组分都要高，其与料液中各组分竞争固定相的结合位点，将吸附的溶质置换下来；同样，吸附作用强的溶质也会竞争吸附作用弱溶质所占据的位点，推动其向出口移动；在优惠吸附系统中，如果色谱柱足够长，各组分按其与固定相亲和力的大小顺序形成彼此相连的纯组分区带；由于置换剂的移动速度一定，故各组分区带的移动速度也为定值，形成“等速置换列”；,亲和色谱,生物亲和作用生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用。本质亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理尚不清楚蛋白质时高分子化合物，种类繁多，结构复杂；蛋白质立体结构中含有某些参与亲和结合的部位，呈凹陷或凸起结构上述结构构恰好能使某些小分子进入到其中，形成构象上的钥匙-锁关系具有亲和作用的分子对之间“钥匙”和“锁孔”的关系是产生亲和结合作用的必要条件亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要分子或原子水平的多种相互作用才能完整地体现亲和作用。,亲和色谱,亲和作用中的相互作用力静电作用氢键疏水性相互作用配位键弱共价键影响亲和作用的因素离子强度（主要源于静电引力，提