生物技术---发酵工程

第四章发酵工程,发酵工程的定义,发酵工程（微生物工程，发酵技术），是指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术，根据各种微生物的特性，在有养或无养条件下利用生物催化（酶）的作用，将多种低值原料转化成不同的产品的过程。,广义上的发酵工程由三部分组成：上游工程、发酵工程和下游工程，其中上游工程包括优良菌株的选育，最适发酵条件（营养组成、pH、温度）的确定，营养物的准备等；下游工程指从发酵液中分离和纯化产品的技术,发酵工业必须具备的条件,1、某种适宜的微生物2、要保证或控制微生物进行代谢的各种条件，即培养基的组成、温度、溶氧浓度、pH等3、微生物发酵需要的设备4、提取菌体或代谢产物或精致产品的方法和设备,发酵工程的特点,投资少见效快污染小外源目的基因易高效表达,发酵工程的历史发展,19世纪末：厌氧发酵(酒精、乳酸、发酵食品)1945年：通气搅拌发酵罐-好氧发酵(青霉素等抗生素)20世纪50年代：代谢控制发酵(氨基酸、核酸等)20世纪70年代：固定化酶连续发酵20世纪80年代：现代发酵工程技术(与基因操作、细胞工程技术相结合),发酵工程的内容,1、微生物的菌体发酵(酵母、单细胞蛋白、药用真菌、杀虫剂等)2、微生物酶发酵(淀粉酶、糖化酶、氨基酰化酶、青霉素酰化酶等)；3、微生物代谢产物发酵(初级代谢产物、次级代谢产物)4、微生物的转化发酵：微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成更有经济价值的产物（抗生素转化）5、生物工程细胞的发酵：是指利用生物工程技术所获得的细胞进行培养的新型发酵，其产物多种多样。（胰岛素、干扰素、青霉素、酚化酶）,初级代谢产物和次级代谢产物,在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、植物生长因子等，这些产物与菌体的生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。,三、发酵技术的应用,1.医药工业：抗生素、维生素、胰岛素、乙肝疫苗、干扰素等；2.食品工业：微生物蛋白、氨基酸、饮料、酒类和一些食品添加剂（柠檬酸、乳酸、天然色素等）；3.能源工业：酒精、沼气、微生物采油；4.化学工业：化工原料（乙醇、丙酮、丁醇）、生物表面活性剂；5.农牧业：生物固氮、生物杀虫剂、微生物饲料；6.冶金工业和环境保护。,发酵工程是生物技术产业化的基础和关键技术，是生物技术四大支柱(基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程)的核心，无论传统发酵产品，如抗生素、氨基酸等，还是现代基因工程产品，如疫苗、人体蛋白质等，都需要发酵技术进行生产。,发酵工程在现代生物技术中的,地位和作用,第二节微生物反应器及发酵系统,生物反应器（发酵罐）：是为微生物、酶或动植物细胞（或组织）作为生物催化剂的生物反应过程提供良好环境的核心设备。根据生物催化剂的不同，生物反应过程分为：发酵过程、细胞培养过程和酶反应过程等，与生物反应过程相应的反应器的为发酵罐、动植物细胞反应器和酶反应器。生物反应器在生物产品生产过程中，具有中心纽带作用，是实现生物技术产品产业化的关键设备，是连接原料和产物的桥梁。因此，生物反应器的设计和操作与生物技术产品的质量、转化率和能耗关系紧密，直接影响到生产效益,发酵罐的特点,1、为细胞代谢提供一个适宜的物理及化学环境，使细胞能更快更好的生长2、具有严密的结构3、良好的液体混合性能4、高的传质和传热速率5、灵敏的检测和控制仪表,发酵罐的设计要求,1、节能2、操作与控制方便3、无菌条件好4、尽量减少法兰连接5、结构坚固、安全6、防止死角、裂缝7、易维修,法兰连接,连接就是把法兰盘放在固定在两处管口上的一对法兰的中间，然后用螺栓拉紧使其接合起来，成为一种可拆卸的。这种连接主要用于铸铁管、衬胶管、非铁金属管和法兰阀门等的连接，工艺设备与法兰的连接也都采用法兰连接。法兰连接的主要特点是拆卸方便、强度高、密封性能好。安装法兰时要求两个法兰保持平行、法兰的密封面不能碰伤，并且要清理干净。,发酵罐的类型,一、根据微生物生长代谢需要来分好氧发酵罐：用于抗生素、酶制剂、酵母、氨基酸、维生素等产品的发酵，发酵过程需要氧气厌氧发酵罐：丙酮、丁醇、酒精、啤酒、乳酸等产品的发酵，发酵过程不需要氧气,二、根据发酵罐的质量传递特点进行分类机械搅拌发酵罐-依靠搅拌器提供能量使发酵液循环、混合、包括机械搅拌通风发酵罐和机械搅拌自吸式发酵罐非机械搅拌发酵罐-依靠通入的空气或液体产生动力，带动发酵液循环、混合，包括喷射自吸式发酵罐、气升式发酵罐,三、根据容积分类实验室发酵罐：500L以下中试发酵罐：500-5000L生产规模发酵罐：5000L以上,好氧发酵罐,1、机械搅拌通风发酵罐搅拌的作用是增加拱氧量2、自吸式发酵罐机械搅拌自吸式发酵罐喷射自吸式发酵罐：文氏管自吸式发酵罐和溢流喷射自吸式发酵罐3、气升式发酵罐,厌氧发酵罐,酒精发酵罐锥底立氏发酵罐,生物反应器工程前景,1、开发活性高，选择性好及寿命长的生物催化剂2、改进生物反应器的传质、传热的方法3、生物反应器向大型化和自动化方向发展4、特殊要求的新型生物反应器的研制开发5、降低设备投资，对连续生物反应器研究更加重视,第三节发酵工程工艺,一、微生物发酵过程的类型,定义：指由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应的过程。根据微生物的种类（好氧、厌氧、兼性厌氧）分（1）好氧性发酵，如柠檬酸发酵，谷氨酸发酵。（2）厌氧性发酵，如乳酸发酵，丙酮、丁醇发酵。（3）兼性发酵，如酵母菌缺氧条件下发酵生产酒精，有氧条件下繁殖菌体。,二、微生物发酵过程的类型,根据培养基状态分：固体发酵液体发酵根据发酵设备分敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵、深层发酵(液体深层发酵),三、发酵工业中的常用微生物,细菌：如枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌等放线菌：如链霉菌属、小单孢菌属、诺卡氏菌属酵母菌：如啤酒酵母、假丝酵母等霉菌：如根霉、曲霉、青霉、红曲霉其他微生物：担子菌、藻类,发酵工业中所用菌种必备的条件,1、菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中迅速生长2、生理性状稳定3、菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求4、无杂菌污染5、生产能力稳定,四、培养基,培养集的种类，依据其在生长中的用途，可将培养基分成：（1）孢子培养基，是供制备孢子用的。（2）种子培养基，是供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。（3）发酵培养基，是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。,四、培养基,发酵培养基的组成（1）碳源：碳架和能量来源糖类、酸、醇、油脂（2）氮源：微生物细胞和代谢产物的成分有机氮：蛋白胨、豆粉、鱼粉等无机氮：氨水、硫酸铵、硝酸盐等。,（3）无机盐和微量元素生理功能：构成原生质的成分；维持酶的活性；调节渗透压和影响细胞的通透性；参与产物的合成,（4）生长因子：维持正常生长维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物、脂肪酸等（5）水：构成菌体细胞的主要成分，营养物质传递的介质、参与代谢反应深井水、自来水、地表水（6）产物形成的诱导物、前体和促进剂,五、发酵的一般过程,培养基原料,培养基配制,培养基灭菌,储备菌种,摇瓶,种子罐,生产罐,培养液,细胞分离,菌体,上清液,抽提,精制,包装,五、发酵的一般过程,1.菌种制备：得到高产高质量的菌株分离、纯化、选育2.种子扩大培养：是指将保存的生产菌种逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程种子制备的方式：菌丝进罐培养；孢子进罐培养,3.发酵：是微生物合成大量产物的过程。必须保证无菌必须定期检测发酵罐内部的代谢变化4.下游处理发酵结束后，要对发酵液和生物细胞进行分离和提纯精制，将发酵产物制成合乎要求的产品。,第四节液体深层发酵,一、发酵的操作方式二、发酵工艺控制三、发酵设备四、下游加工过程,一、发酵的操作方式,分批发酵连续发酵补料分批发酵,分批发酵,定义：在一个封闭培养系统内具有初始限量基质的一种发酵方式，每批发酵所需时间的总和为一个发酵周期。营养物和菌种一次加入进行培养，与外部没有物质交换。过程：空罐灭菌、加入灭过菌的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐生长周期：延滞期、加速期、对数生长期、减速期、稳定期、衰亡期,连续发酵,定义：是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持稳定，微生物在稳定状态下生长。反应器：搅拌罐式反应器和管式反应器,连续发酵与分批发酵的比较,优点：1.微生物的生长和产物形成保持稳定；2.能实现机械化和自动化；3.提高设备利用率，缩短发酵周期；缺点：1.容易造成杂菌污染；微生物易发生变异2.对设备、仪器及控制元件的技术要求较高；,补料分批发酵,定义：是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。类型：单一补料分批发酵反复补料分批发酵,补料分批发酵,优点：1.解除阻遏效应2.控制细胞量和耗氧量3.提高有用产物的转化率4.降低发酵液的粘度5.避免菌种老化和变异,二、发酵工艺控制,反映发酵过程变化的参数：直接参数温度、压力、pH、溶解氧、基质浓度、搅拌功率、转速、泡沫、粘度、离子浓度等间接参数生长速率、产物合成速率、呼吸商呼吸商:(respiratoryquotient,RQ)营养物质氧化过程中生成的二氧化碳与所消耗的氧量的容积比值。,温度的控制,温度对发酵的影响影响发应速率影响生产菌的生物合成影响生物合成的方向温度控制冷却,pH对发酵的影响及其控制,pH对发酵的影响影响菌体的新陈代谢影响菌体对营养物质的吸收及产物的排泄影响菌体对某些组分和中间代谢产物的利用影响代谢产物的积累最适pH的选择与pH的控制加糖、加酸、加碱,溶解氧对发酵的影响及其控制,对发酵的影响代谢异常、产量降低溶解氧的控制供氧：调节搅拌速度或通气速率需氧：控制菌体浓度,三、发酵设备,好氧发酵设备机械搅拌发酵罐通风搅拌发酵罐厌氧发酵设备,机械搅拌发酵罐,利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促进氧的溶解。包括：通用式发酵罐：机械搅拌和压缩空气分布装置自吸式发酵罐：带中央吸气口的搅拌器,通风搅拌式发酵罐,通风的目的：不仅是供给微生物所需要的氧，同时还利用发酵罐的空气，代替搅拌器使发酵液均匀混合。包括：空气带升式发酵罐高位塔式发酵罐,厌氧发酵设备,特点：排除发酵罐中的氧气需大剂量接种,四、下游加工过程,从发酵液中分离、精制有关产品的过程称为发酵生产的下游加工过程。是发酵生产中最重要、成本费用最高的环节。一般可分为四个阶段：1、发酵液预处理和固液分离：过滤、离心等；2、提取：吸附发、离子交换法、沉淀法、萃取法、超滤法（膜过滤法）；3、精制：层析分离；结晶4、成品加工：浓缩、无菌过滤、去热原、干燥、加稳定剂。,发酵液,预处理,(加热、调pH、絮凝),细胞分离,(沉降、离心、过滤),细胞破碎,细胞碎片分离,(高压均质处理、研磨、溶菌),细胞,(离心分离、萃取、过滤),初步纯化,高度纯化,成品加工,(沉淀、吸附、离子交换、萃取、超虑),(沉淀、超虑、层析分离、结晶),(无菌过滤、超虑、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶),下游