海洋生物技术--第二章-海洋动物细胞工程

第二章海洋动物细胞工程,目录,一概述二动物细胞的形态结构和生理特点生产用动物细胞系的要求和获得动物细胞的培养条件和培养基动物细胞培养的基本方法动物细胞培养方法和操作方式动物细胞生物反应器动物细胞产品的纯化方法和质量要求动物细胞工程的实例细胞工程在海洋动物中的应用,一、细胞工程的概念,应用细胞生物学、遗传学、发育生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计和需要，通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植，以及组织、细胞培养等方法，在细胞整体水平或细胞器水平改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品，甚至培养出新物种的一门综合性生物工程技术科学。,第一节概述,二、细胞工程技术,细胞融合技术细胞培养技术细胞器移植技术染色体工程组织培养技术（干细胞工程）,细胞融合，又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的现象。正常人体内也有细胞融合现象，如两性生殖细胞结合而成受精卵，多个巨噬细胞融合成一个体积很大的多核异物巨细胞。,（一）细胞融合技术,两个细胞正在融合,受精作用,19世纪30年代，Muller,Schwann,Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象。1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在。1855年1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。1859年，A.Barli研究发现某些黏虫存在着由单个细胞核融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞融合而成。,细胞融合现象的发现,细胞融合的过程：细胞在促融因子的作用下，出现凝集现象，然后，细胞之间的质膜发生粘连，细胞开始融合，然后在培养过程中，进而发生核融合，形成杂种细胞。,体外用人工方法使两种细胞融合，制成一种新品系的杂交细胞，筛选出的杂交细胞有很强的生命力，增殖也很旺盛。常用的细胞融合诱导物是仙台病毒和聚乙烯丙醇（PEG）。,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法化学法,仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,思考讨论：为什么使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？,细胞融合技术是细胞遗传学、细胞免疫学、病毒学、肿瘤学等研究的一种重要手段；如将受抗原刺激后的小鼠脾淋巴细胞分离出来，与已建成的小鼠骨髓瘤（浆细胞瘤）细胞融合，筛选出的杂交瘤细胞可长期存活和增殖，成为制备单克隆抗体的细胞株。,1.动物细胞培养的概念：,动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,（二）动物细胞培养技术,动物组织细胞培养技术的建立,1907年，美国胚胎学家R.Harrison将蛙的胚神经组织移植到蛙的淋巴液凝块中，首创体外组织培养法。1912年，Carrel发现了鸡胚浸出液对某些细胞的生长具有很强的促进效应，并把无菌技术引入组织培养技术中，在不含抗菌素的培养条件下使鸡胚心脏细胞维持生存了34年，先后继代3400次，证明动物细胞有可能在体外无限地生长。1940年，Earle建立了可无限传代的一个C3H小鼠的结缔组织细胞系。1951年，开发了能促进动物细胞体外培养的人工培养液。,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,单个细胞,加培养液,制成,细胞悬浮液,10代细胞,部分细胞“癌变”，无限传代,动物细胞培养不能最终培养成动物体,50代细胞,原代培养,传代培养,细胞贴壁,剥离、分瓶,细胞株,细胞,细胞系,2.动物细胞培养过程：,动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,思考讨论：在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？,胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。,（三）核移植技术,动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中。使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。,另一头绵羊的子宫,克隆羊培育过程,1997年2月，英国科学家Wilmut等在世界权威杂志Nature上首例报道了世界第一只克隆羊的诞生。它的贡献在于：证明了哺乳动物高度分化的细胞同样含有全套遗传信息，亦能在一定条件下发育成动物个体，进一步证明了动物细胞的全能性。1998年，Thomason成功建立人胚胎干细胞系。,细胞工程的主要技术及其应用,第二节动物细胞的形态结构和生理特点,一、动物细胞的形态与结构适应功能,形态各异。,贴壁细胞生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。两种形态：成纤维细胞型（细长）上皮细胞型（圆形、多角形或放射形）,离体培养细胞分三类：贴壁细胞；悬浮细胞；贴壁-悬浮,悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。兼性贴壁细胞生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。,二、动物细胞的生理特点,细胞的分裂周期长细胞分裂时间为1248h，细胞的分裂周期=间期+分裂期间期（G1+S+G2），分裂期（M）,G1期：46h，合成DNA聚合酶，RNA合成；S期：68h，DNA合成；G2期：25hDNA量加倍,RNA合成；M期：分裂期，0.51h染色体分裂,细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限，可称为有限细胞系，如可以连续培养，则称为连续细胞系(无限细胞系)，培养50代以上并无限培养下去。,有关概念:,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,动物细胞对周围环境十分敏感;对理化因素敏感，如：渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等。原因？,动物细胞对培养基要求高。必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。,动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。动物细胞蛋白质的合成部位为游离核糖体和粗面内质网的核糖体，有糖基化修饰，且多为分泌胞外蛋白。,动物细胞培养：缺点:培养条件高、成本贵、产量低。优点:分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。,第三节生产用动物细胞系的要求和获得,一、生产用动物细胞的要求:原代细胞二倍体细胞系连续细胞系（转化细胞系）重组细胞系,二、生产用动物细胞的获得,原代细胞是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。需要大量动物，费钱费劳力。生产用最多的鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。,（1）原代培养,定义：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续14周。步骤：取材-组织分离-培养方法：组织块培养法、分离细胞培养法,动物组织块培养法,将动物组织切成直径为12mm的小块、并且进行培养的方法称为动物组织块培养法。有些动物组织如人的皮肤细胞，由于分散成细胞十分困难，因此常常采用组织块培养法。动物组织块固着之后，加培养液，于37、CO2培养箱中、通入含5%CO2的空气进行培养，即可在组织块周围长出新的细胞单层。动物组织培养过程中，进行旋转或者振荡，培养效果更好。,组织块分散成单细胞,消化分散组织块的方法分为三种：酶消化法：将组织块切成12mm的立方小块，置蛋白酶溶液中进行消化分散，离心收集细胞，经过平衡盐溶液洗涤，加培养基后于4条件下贮存备用。物理分散法：将组织小块通过加压过筛的方法进行机械分散，形成单个细胞和细胞团块。酶消化与物理分散结合法：动物组织先经过酶消化，再用电磁搅拌进行物理分散。,（2）传代培养,定义：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后转至新的培养瓶的过程。注意：原代细胞类型不一，需要不同的消化时间和消化液。步骤：A贴壁细胞：去除培养基-胰蛋白酶消化-加入培养液，形成细胞悬液-稀释-培养B悬浮细胞：收集细胞悬液-离心搜集细胞-用培养液稀释-培养,二倍体细胞系原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出具有一定特征的细胞株。,二倍体细胞有正常细胞的特点：染色体组型是2n核型；贴壁依赖接触抑制；可传代培养50代；无致瘤性。,二倍体细胞的培养意义,二倍体细胞保留着在位组织正常的细胞性状。（1）可用于生产疫苗、尿激酶、干扰素等药物的生产。（2）也可用于细胞遗传学、细胞分化及衰老的研究、以及药物的细胞毒性、环境污染的细胞学检测。,二倍体细胞的来源,来源于3-4个月的胚胎肺组织。目前已获得了多种人胚肺二倍体细胞，如：W1-38MRC-5MRC-9IMR-902BSKBM-13LS-7,二倍体细胞的培养特征,影响二倍体细胞培养的因素有：分种率。一般不超过1：8，细胞密度应大于104个/平方厘米，否则死亡率大，细胞难以成层。继代寿命。细胞培养中需及时进行继代培养，否则细胞容易退化、衰老和死亡。PH值。应大于7.2，最好通过CO2培养箱和有机缓冲液如HEPES来稳定培养液的PH值。,70年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性，WI-38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系。二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，一般可传代培养50代，且无致瘤性；现在传代细胞系已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但仍不是理想的生产细胞系。,转化细胞系（无限细胞系）通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的或人工的，从肿瘤组织中分离。,4.融合细胞系仙台病毒融合法聚乙二醇融合法电融合法,5.基因工程细胞系利用基因工程技术改造编码蛋白质的基因并转化到新宿主细胞内进行表达。这些利用基因工程技术构建的细胞系成为基因工程细胞系。,三、常用生产用动物细胞的特性(了解),W1-38MRC-5CHO-K1BHK-21VeroNamalwa,四、细胞库的建立生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库生产用细胞库,原始细胞库贮存时须有该细胞的详细挡案，包括：该细胞系的历史该细胞系的特性对各种有害因子的检查结果,生产用细胞库来自原始细胞库，或从单一安瓶来，或从多个安瓶来即刻混合，经培养扩增再分装储存形成细胞库。需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染的检查。需确定最高使用的传代数。,一、动物细胞培养所需仪器设备,实验室要求和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等，入内换上。室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥。侧部可设传递窗，用于物品传递。有消毒用紫外线灯。,第四节动物细胞的培养条件和培养基,普通细胞培养室内走廊,（1）培养器具,培养瓶（安瓿瓶）,培养板,培养皿,96孔、55孔、24孔,（2）超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。,单人单面超净工作台双人单面超净工作台,生物安全柜,（3）CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37，5CO2。二氧化碳的作用：维持PH值。,二氧化碳培养箱,气压测试,（4）倒置显微镜,倒置显微镜,（5）纯化水装置,纯水制备系统高压灭菌锅干燥箱,清洗与灭菌室,储藏室,细胞计数板,过滤器:可以将滤膜装入后整体进行高压消毒。,玻璃漏斗式滤器,微孔滤膜滤器,离心机,离心管,移液管SerologicalPipette,吸管PasteurPipette,PasteurPipette,移液器,移液器,多通道微量移液器,PipetteTips,显微操作仪Micro-manipulator,细胞融合仪,手术器械,二、动物细胞在体外培养所需基本条件所有与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染；必须有足够的营养保证，绝对不能含有害的物质，避免有害离子；保证有足量的氧气供应；需随时清除细胞代谢中的有害产物；有良好的适于生存的外界环境：渗透压、离子浓度和酸度；及时分种，保持合适的细胞密度。,三、动物细胞培养基的种类和组成天然培养基合成培养基无血清培养基,天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。,1天然培养基,天然培养基血清的种类：小牛血清取自出生1030天的小牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;胎牛血清取自剖腹产的胎牛，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少;,血清的主要成分和作用主要成分：血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。主要作用：提供基本营养物质；提供激素和各种生长因子；提供结合蛋白；对培养中的细胞起到某些保护作用。,使用血清的优缺点牛血清的优点：来源充足；制备技术成熟；经过长时间的应用人们对其有比较深入的了解。细胞培养中使用血清的缺点：改变某种细胞在体内的正常状态；含有一些对细胞会产生毒性的物质；每批血清都有差别，其成分不能保持一致；取材过程有可能带入支原体、病毒。,合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中已知物质在体外人工条件下的模拟，经反复试验筛选、强化和重新组合后人工设计、配制的培养基。目前合成培养基已经成为一种标准化的商品，从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且还在不断发展。合成培养基的出现极大的促进了组织培养技术的普及发展。,2合成培养基,合成培养基的成分,氨基酸（细胞合成蛋白质的原料）；维生素（维持细胞生命活动的低分子活性物质，形成酶的辅基或辅酶）；糖类（碳源）；无机盐（保持细胞的渗透压并参与代谢）；其他（前体和氧化还原剂）。,小牛血清的作用：1、提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；2、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子；3、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；4、提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素。,抗菌素的使用动物细胞培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位，方便、广谱、稳定。,3无血清培养基无血清培养基即不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养实验的要求，但对有些实验却不适合。如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用，而血清中可能含有这些生长因子。,无血清培养基的优点：提高了细胞培养的可重复性，避免，避免了由于血清批次之间差异的影响；减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；供应充足、稳定；细胞产品容易纯化；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析。,无血清培养基的基本配方基础培养基及添加组分两大部分。基础培养液以HamF12和DMEM最为常用，一般两者以1:1混合。添加组分包括以下几大类物质：生长因子和激素结合蛋白贴附因子和伸展因子有利细胞生长的因子和元素,如何选择培养基选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640；进行细胞杂交、基因转移实验，可选择IMDM.用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、菌落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法。,第五节动物细胞培养的基本方法,动物细胞的大规模培养方法：根据培养细胞可分为原代细胞培养和传代细胞培养；根据培养基不同分为液体培养和固体培养根据培养容器和方式可分为静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床和流化床培养；实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。,一细胞分离,1.离心分离法2.消化分离法,二细胞计数,1.自动细胞计数器计数2.血球计数板计数3.染色计数活细胞法,染料排除检测法,台盼兰染料排除检测法的原理,染料,普通光学染料：台盼兰(trypanblue)、伊红Y(eosinY)荧光染料：碘化丙锭(propidiumiodide，PI)、Hoechst33258、溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)、Hoechst33342（H342）。,普通光学染料,碘化丙锭只能质膜破损的细胞，与DNA结合,荧光染料,PI/H342双重荧光染色观察细胞活率，箭头所示为活细胞,三细胞传代,1.悬浮细胞传代2.贴壁细胞的传代,冻存和复苏的原则：慢冻快融,零度以下，细胞的细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,四细胞的冻存和复苏,1.细胞的冻存,细胞保存的方法：（1）常温法：将特定的动物细胞于2030下进行保存的方法。如人羊膜细胞单层于28下可保存1个月；人肾细胞单层于2530下可保存1个月以上。（2）低温法：将特定的动物细胞于4下进行保存的方法。如人胚组织块于4下可保存1430天。（3）超低温冷冻法：将特定的动物细胞于-70以下或者在液氮中进行保存的方法。超低温冷冻法可以长期保存动物细胞，如二倍体细胞2BS自1973年来保存至今，其遗传性仍然没有变化。,慢冻程序,标准程序：当温度在-25以上时，降温速率控制在12/min；当温度达-25以下时，降温速率控制在510/min；当温度达-100时，可迅速放入液氮中；细胞冻存器。简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,防冻剂,超低温冷冻法需要使用防冻剂，以减少细胞在冻结过程中所受到的损伤。常用的防冻保护剂有：甘油、DMSO（二甲基亚砜）。甘油：毒性较小，能够结合水，减少组织结冰量，防止细胞内盐浓度升高，具有保护细胞的作用。其使用浓度一般为520%。DMSO：是目前应用较多的一种保护剂，使用浓度为512.5%，与甘油相比，DMSO抗冻能力更强。,2.细胞的复苏,复苏过程要防止安瓿瓶的爆炸和消毒处理。,从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中，使其融化（1分钟左右）。5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。低速离心10分钟。去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,第六节动物细胞培养方式和操作方式,一、动物细胞的大规模培养方法按照实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。,1、悬浮培养优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。缺点：体积小，较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌和气升式。,2、贴壁培养优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。,3、贴壁-悬浮培养(固定化培养)（1）微载体培养，优点：可创造相当大的贴附面积，载体体积较小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，发挥悬浮培养的特长。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当（1.0301.045g/ml）、粒径均一，在60250m之间（溶胀后）、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分。（2）包埋和微囊培养，包埋或包裹在凝胶载体和微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；通过控制微囊膜的孔径可使产品浓缩在微囊内有利于下游处理；可采用多种生物反应器进行大规模培养。（3）结团培养，利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养。优点是操作简单、节省微载体用量。,二、动物细胞培养的操作方式分批式、流加式、半连续、连续式、灌注式、细胞工厂培养，见发酵工程相关内容。,第七节动物细胞生物反应器,一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构搅拌式生物反应器气升式生物反应器中空纤维式生物反应器透析袋或膜式生物反应器固定床或流化床式生物反应器,搅拌式生物反应器,通过借鉴细菌发酵罐得到的动物细胞反应器，有如下特点：（1）罐体的高径比一般采用11.5：1，利于增大与空气的接触面；培养动物的罐底为圆形，以避免细胞和载体沉积在周边；（2）为防止搅拌产生的切力损伤细胞，搅拌速度慢，一般在20100r/min，故多数倾向于采用较大的倾斜式桨叶搅拌器或船舶推进式桨叶搅拌器；（3）一般采用无气泡通气系统，以解决由于气泡破裂时产生的应力对细胞的损伤；（4）高密度、长时间培养以及提高反应器的生产效率考虑，反应器常常需要配备有进出液体系统，以便进行灌流培养，并有使细胞与培养基分离使细胞保留在反应器内的装置。,气升式生物反应器,与搅拌式生物反应器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，由于没有了机械搅拌的结构，有利于设备的密封，降低了造价。高径比一般在10：1左右。,中空纤维式生物反应器,由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为50100m，呈多孔性，内层为超滤膜，内腔直径为200m，两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。,平床式中空纤维式生物反应器,该反应器占地空间小，产品产量、质量高，生产成本低。不足之处在于：不能重复使用；不能耐受高压灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌；难以取样检测。为克服这些不足，新型平床式中空纤维生物反应器被开发出来，培养原代人胚肾细胞时，用无血清培养基，细胞在5周内一直很稳定地产生尿激酶。,在动物细胞培养过程中，产生的代谢产物（乳酸和氨等）对细胞的生长和产物的产生会产生抑制作用。透析袋或膜式反应器可将这些有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分离开。,4.透析袋或膜式生物反应器,结构较简单，装填的材料可以是一切对细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料，有实心载体和有孔载体两类。（1）CF-IMMO培养系统，或SF-2000流化床生物反应器，该类反应器专用于比重较大的微球的培养。微球由胶原制成，直径为500m，孔径约2040m，比重为1.61.8g/ml。液流向上时，微球在一定范围内浮动或旋转，保证了微球内细胞可获得充分的营养和氧。,5.固定床或流化床式生物反应器,（2）CelliGenplus生物反应器，将通气搅拌与固定床结合的一种新型生物反应器。,二、动物细胞生物反应器的检测控制系统,培养过程需检测的物化参数直接在线检出：温度、pH值、搅拌速度等取样离线检测：活细胞数等；检测后计算：倍增时间等。,主要参数的检测和控制方法,温度pH在培养初期，控制进氧量当细胞密度提高后控制NaHCO3的量,溶氧搅拌进出液流量其它,一动物细胞产品的常用纯化方法1.离心2.离子交换层析3.凝胶过滤4.亲和层析5.盐析和有机溶剂沉淀6.透析7.高压液相层析,第八节动物细胞产品的纯化方法和质量要求,二动物细胞产品的质量要求1.对工程细胞的要求2.对生产工艺的要求3.对产品的质量要求,第九节动物细胞操作的实例,组织纤溶酶原激活剂（tPA）生产工艺：组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，与纤维蛋白结合后形成的复合物可使纤溶酶原活化为纤溶酶。纤溶酶可水解纤维蛋白，导致血栓溶解，故对血栓性疾病有较好疗效。人黑色素瘤细胞株培养后可产生大量的tPA，其培养液中tPA浓度可达到1毫克/升。,1）工艺流程细胞单层、细胞悬液、细胞培养物、培养液、提取液、层析液、浓缩液、层析液、tPA成品,2）工艺过程A培养基配制；BtPA抗体制备；C抗tPA亲和吸附剂制备；D细胞培养；EtPA的分离；F精制。,（1）t-PA抗体的制备,取人t-PA、或者猪心t-PA按每只家兔200-300ug的计量，t-PA采用福氏完全佐剂充分乳化，注射入家兔皮下。每隔2周再用t-PA100ug进行加强免疫，共加强2次取家兔血清用50%硫酸铵盐析沉淀物于0下，用生理盐水透析经过Sephadex75柱层析得到抗t-PA的免疫球蛋白IgG备用,（2）抗t-PA的亲和吸附剂的制备,A、Sepharose4B的活化B、抗t-PA的亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备,A、Sepharose4B的活化,Sepharose4B用10倍体积的蒸馏水（V/V）多次漂洗、布氏漏斗抽滤取20克Sepharose4B湿凝胶放入500ml的三颈烧瓶中，加蒸馏水30ml，搅均匀后，用2mol/L的NaOH溶液调节PH=11，降温至18在通风橱中，另取溴化氰1.5g于乳钵中，加入30-40ml蒸馏水分多次研磨溶解将溴化氰溶液倒入三颈烧瓶中，升温至20-22，同时滴加2mol/L的NaOH溶液调节PH=11-12等反应液PH值不变时，继续反应5分钟，取出烧瓶，向其中投入小冰块降温，用3号垂熔漏斗抽滤用300ml、4、0.1mol/L的NaHCO3溶液洗涤。然后用300ml、PH=10.2、0.025mol/L的硼酸缓冲液分3-4次抽滤洗涤最后转移至250ml的烧瓶中，加入50-60ml的硼酸缓冲液，即得活化的Sepharose4B，备用,B、抗t-PA的亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备,取步骤-2中的抗t-PA的免疫球蛋白IgG，70-80mg溶于20ml硼酸缓冲液中、过滤。滤液加入到已经活化的Sepharose4B中，10下搅拌反应16-18小时第二天装柱，用10倍柱床体积（V/V）、PH=10.2的硼酸缓冲液，以5-6ml/min的流速洗涤柱床。收集流出液，测定其A280用5倍柱床体积（V/V）的、PH=10.0、0.1mol/L乙醇胺溶液洗涤柱床用5倍柱床体积（V/V）的、PH=8.0、0.1mol/L硼酸缓冲液洗涤柱床用5倍柱床体积（V/V）的、PH=7.4、0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤平衡。直到流出液的A280小于0.01，所得到的固定化抗t-PA的免疫球蛋白IgG，就是待提取的t-PA的亲和吸附剂。将其转移至含0.01%NaN3的、PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液中，于4下贮存，备用。,（3）细胞培养,取5L玻璃转瓶，按每平方米表面积2.5L的比例加入细胞培养液。将人黑色素瘤细胞按常规方法消化分散、洗涤、计数、稀释成细胞悬液。将细胞悬浮液接种到转瓶之中，接种浓度为1033103个/ml