第二章生物工程

第二章工业微生物的菌种选育,微生物是各种活性物质产物的丰富源泉。生物活性物质很多，有微生物的初级代谢产物，如氨基酸，多糖、核酸，维生素等，有微生物的次级代谢产物，如抗生素、酶抑制剂、色素等。因此，微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。,为什么要育种？自然界分离的菌种生产性能差,例子,红霉素产生菌在发酵遇有噬菌体侵袭时，产量大幅度下降，甚至停产，经诱变处理，获得抗噬菌体的特性。卡那霉素产生菌经诱变后，由产生卡那霉素A变成产卡那霉素B。,理想的产生菌应符合以下要求(1)遗传性状稳定；(2)生长速度快，不易被噬菌体等污染；(3)目标产物的产量尽可能接近理论转化率；(4)目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离；(5)尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离；(6)培养基成分简单、来源广、价格低廉；(7)对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；(8)对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。,第一节工业微生物的育种,工业微生物的育种：运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。,一、工业育种简介,1.工业菌种育种的方法自然育种诱变育种杂交育种（常规杂交育种、原生质体融合）分子育种,第二节自然选育,自然选育指在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。,自然选育的作用：自然选育在工业生产中可以达到纯化菌种，防止菌种衰退，稳定生产，提高产量的目的。,自然选育最为成功的例子是目前被广泛使用的卡介苗(BCGvaccine)。法国的卡尔密脱(Calmette)和介林(Guerin)把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续传代培养230代，前后经历13年时间，终于在1923年获得显著减毒的结核杆菌-卡介苗。,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落(注意形态的观察),发酵试验,一般自发突变的频率较低，变异程度不大，所以，用该法培育新菌种的过程十分缓慢。后来发展了诱变育种、杂交育种、尤其是基因工程等育种技术。,一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。,第三节诱变育种,诱变育种：通过诱变剂处理,提高菌种的突变频率,扩大变异幅度,从中选出具有优良特性的变异菌种。,最突出的例子青霉素生产菌株的选育。1943年，产黄青霉每毫升发酵液只产生约200单位的青霉素，通过透变育种和其它措施配合，目前的发酵单位已比原来提高了，达到每毫升5万10万单位。,一、突变诱发过程,（一）诱变剂接触DNA分子前细胞对诱变剂的透性将影响诱变效果,（二）DNA损伤的修复1、光复活紫外线照射过的DNA在黑暗中结合，形成的复合物，在可见光下，可见光能激活一些酶，酶和DNA解离，解离下来的DNA分子就不存在原来的TT二聚体。,2、切补修复四种酶参与反应。首先由核酸内切酶切开二聚体的5末端,形成3-OH和5-P的单链缺口，然后，核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口，接着，DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段，最后，由连接酶将新合成链的3-OH与原链的5-P相连接。,3、重组修复改变胸腺嘧啶二聚体的情况下的修复系统，即重组修复(recombinationrepair)。重组修复必须在DNA进行复制的情况下进行，所以又称为复制后修复(postreplicationrepair)。,DNA多聚酶和连接酶,DNA复制,4、SOS修复系统当DNA受到诱变剂损伤而阻断DNA复制过程时，DNA损伤相当于一个呼救信号，促使细胞中的有关酶系解除阻遏，进行DNA的修复。,3,5,3,5,DNA多聚酶在无模板的情况下进行DNA的修复合成。将合成的DNA片段插入受损的DNA片段。,5、DNA多聚酶的校正作用细胞对复制过程中出现的差错加以校正。,（三）从前突变到突变前突变：造成DNA分子的某一位置结构改变。细胞中的修复都会对诱变效果产生影响。对诱变不利：光复活作用切补修复DNA多聚酶校正,校正差错,有利于诱变：重组修复SOS修复,引起差错,(四)从突变到突变型表型迟延：表型的改变落后于基因型改变的现象。,表型迟延的两种原因：分离性迟延生理性迟延,1、分离性迟延经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态（野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中）突变型基因由于属于影性基因而暂时得不到表达，需经过复制，分离，在细胞中处于纯的状态时，其性状才得以表达。,细菌的分离性迟延,异核体细胞,突变的核质体,2、生理性迟延新的表型必须等到原有的产物稀释到某一程度才能表现出来，而这些原有基因产物的浓度稀释到能改变表型的临界水平时，细胞已经分裂多次。,例如：某个产酶基因发生突变，可是细胞中原有的酶仍在起作用，细胞表型仍为野生型，只有细胞分裂多次，原有的酶足够稀释，才出现突变型的表型。,二、诱变方法,1、诱变方法：物理诱变化学诱变,1）物理诱变剂：射线如紫外线X射线射线快中子,2）化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。,三、诱变育种步骤,操作步骤：出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养筛选,(一)出发菌株的选择,1选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响例如：在柱晶白霉素产生菌选育中：1）采用不纯的出发菌株，经36代传代，发酵单位从30U/ml提高到2000-3000U/ml。2）采用纯种，经32代传代，发酵单位从30U/ml提高到12000U/ml。,2选择产量高、产孢子多，生长快的菌株3对诱变剂敏感的菌株,(二)处理菌悬液的制备,制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液孢子计数：常用孢子浓度105-108个孢子/毫升,(三)诱变处理,根据已经成功的经验，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,(四)中间培养,由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个分离性迟延、生理性迟延的过程，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。,(五)筛选,初筛：以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛：以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.,例如：初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将近90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。,一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。,例子：紫外线的诱变育种,1、采用15W紫外线杀菌灯，波长为253.7A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。,操作方法,2、被照射菌悬液浓度以及厚度：细菌为106个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为105108个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。,3、致死率计算：取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。4、中间培养取照射菌液液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120rmin振荡培养。5、筛选取中间培养液稀释分离、培养，挑取菌落进行筛选。,菌株选育典型流程,出发菌株（砂土管或冷冻管）小试原种特性考擦斜面或摇瓶培养24h培养基优化单孢子悬液菌悬液挑出高产菌株诱变处理摇瓶复筛处理前后计数稀释涂平板传种斜面观察单菌落形态挑选单菌落转种斜面保藏菌株摇瓶初筛对照组比较挑出高产斜面,中试,投产试验,第四节营养缺陷型的选出,营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。,一.筛选营养缺陷型的方法,淘汰野生型检出缺陷型,1.淘汰野生型,抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。,菌丝过滤法：对于霉菌（野生型），在基本培养基上，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤去。,二、检出缺陷型,原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。具体方法：影印法、点种法、夹层法,1将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。2将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。3将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。,(一)影印法,4将CM和MM在恒温箱中培养。5二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于CM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型注意：要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。,(二)点种法,用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工作量大。,(三)夹层法,先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂