基因工程制药工艺

生物制药工程,主讲教师：刘凯liukai_1982山东农业大学生命科学学院微生物系,第六章基因工程制药工艺,6.1基因工程制药微生物表达系统6.2基因工程大肠杆菌的构建6.3基因工程菌的发酵培养与控制,基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：上游阶段：实验室内完成克隆目的基因目的基因的表达,基因工程药物生产的基本过程,下游阶段：将实验室的成果产业化、商品化工程菌大量培养产品的分离纯化和质量控制。,基因工程药物研究的技术路线-上游技术,PCR筛选，酶切确认，提取质粒测序,诱导表达,分离纯化目的蛋白,转化宿主细胞,基因工程药物涉及的技术,RNA提取及操作,防RNA酶引物设计cDNA合成PCR质粒提取限制性内切酶操作DNA连接制备大肠杆菌感受态细胞转化大肠杆菌无菌操作制备各种培养基,12.琼脂糖电泳13.蛋白质纯化14.SDS-PAGE15.微生物发酵技术16.动物细胞培养技术17.熟悉DNA分析软件18.熟悉分子生物学常用网站,基因工程菌,概念：以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因，或过量表达或抑制自身基因的工程生物体。种类：基因工程大肠杆菌和酵母：重组蛋白质药物基因工程技术改造出发菌：氨基酸、抗生素、甾体激素、中间体生产,6.1.1大肠杆菌系统,1、大肠杆菌（Escherichiacoli）形态特征细胞：G-，单细胞，杆状，鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。菌落：白色至黄白色，光滑，直径23mm,2、生化与遗传特性能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气、产酸。繁殖一代约17min基因工程中使用菌株：K-12株的衍生菌株基因组：4.6Mbp，3000多种蛋白质染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒,3、质粒载体,质粒载体的基本特征,自主复制性：复制子复制起始点及控制复制频率的调控元件。质粒DNA不依赖于染色体DNA而自主复制。选择标记：质粒编码的选择标记，产生一种新的表型，用于转化体的筛选。如：抗生素抗性基因，氨苄、四环素、卡那等。多克隆位点：外源基因插入载体的位置，由多种常见的限制性内切酶位点序列构成。不相容性：具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一宿主细胞内。转移性：通过细菌接合作用从一个宿主转移到另一个宿主细胞/菌,质粒类型严谨型质粒：每个细胞含少数拷贝质粒松弛型质粒：每个细胞含几十至几百拷贝质粒克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因测序质粒：用于基因测序整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在表达质粒：能表达基因产物,表达载体MCS附近结构,启动子操纵子核糖体结合位点MCS终止子,4、产物表达形式,不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体可溶性蛋白质：存在于细胞质周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质空间，可溶性胞外表达：胞内可溶性蛋白质分泌到培养液中,5、大肠杆菌表达系统的问题缺点:1）缺乏翻译后修饰，如糖基化2）常形成包涵体，复性效果差3）蛋白质易被降解4）内毒素难以除尽，产生热源5）N端增加的蛋氨酸容易引起免疫反应优点:1）简单，经济，快速2）适合于制备抗体，供下游研究,6、应用,大量外源基因能超量的表达，18种药物上市多肽类：2种（甲状旁腺激素1-34、利尿钠肽）激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素（1种PEG化）细胞因子类：5种干扰素（1种PEG化）、干扰素和，2种G-CSF（1种PEG化）、白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂溶栓酶类：rPA（reteplase，瑞替普酶）白喉毒素-1L2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等,6.1.2酵母表达系统,1、形态特征细胞：单细胞真核生物，球形，椭圆形，卵形繁殖：芽殖、裂殖，在特定条件下才产生子囊孢子菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐,2、生长与遗传特征,两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体结合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2h酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景相对清楚基因组：120.68Mbp，5887个ORF，编码约6000个基因,表达载体穿梭载体,含有复制起始序列或整合序列、选择标记以及由启动子、终止子和信号肽序列构成的表达盒序列。四种类型YIp酵母整合载体YCp酵母着丝粒载体YRp酵母复制载体YEp酵母附加载体,YIp酵母整合载体：选择标记和MCS，无自主复制序列，有整合序列。同源重组整合到酵母染色体，随同染色体一起复制和遗传。YCp酵母着丝粒载体：着丝粒序列和自主复制序列。可自主复制，拷贝数很低，无选择性，极易丢失，主要用于文库构建和基因克隆。YRp酵母复制载体：酵母基因组DNA复制序列，可独立自主复制，转化效率高。但存在分配不均一性，母细胞中远远多于子细胞中。无选择压，容易丢失。常用于试验研究，很难工业化应用。YEp酵母附加载体：复制子，可自主复制，高拷贝，转化频率高。改造后，无需选择压就能高拷贝稳定分配，在大规模无选择培养中是非常有用的，用于过量表达外援基因。,3、优点与不足,载体：安全、无毒营养缺陷选择外来质粒培养条件简单，大规模培养技术成熟亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力缺点：酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用,4、应用,1981年，Nature，Hitzeman等在酵母中表达人干扰素激素类：67种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子多肽类：高血糖素2种乙肝疫苗等,5、毕赤酵母表达系统,酿酒酵母表达系统Saccharomycescerevisiae过去常用,毕赤酵母Pichiapastoris现在多用,Pichiapastoris表达系统,Pichiapastoris是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯一的碳源；易操作，培养容易；表达量高,可达培养液中10g/L；可以有真核生物的翻译后修饰，如糖基化；避免了酿酒酵母的过糖基化问题。,毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：1.蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。2.操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。3.同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。,毕赤酵母系统的注意事项,严格无菌操作，防止污染；可以镜检温度30C转化PCR检测5.诱导时间,蛋白质糖基化,蛋白质的糖基化是真核生物的一种常见的翻译后修饰方式；糖基化影响蛋白折叠、定位、转运、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期。,酵母蛋白糖基化,酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型；然而毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链814个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50150个甘露糖残基）短得多；