园艺科学研究方法-园艺作物抗氧化物质提取剂活力测定

园艺科学研究方法园艺植物育种研究,衰老是机体不可避免的生理过程，衰老时体内发生一系列生理生化变化，变化发生的机制目前尚不清楚，学说众多.,其中，Harman于1956年提出的衰老自由基学说已经得到许多试验结果的支持。他认为衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。生物体的衰老过程是机体的组织细胞不断产生的自由基积累结果。,氧自由基(活性氧)的种类,活性氧的产生途径：、正常生理代谢过程中会产生活性氧，、一些环境因子例如紫外照射、射线照射、吸烟、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。,一般情况下，生命是离不开自由基活动的。我们的身体每时每刻都从里到外的运动，每一瞬间都在燃烧着能量，而负责传递能量的搬运工就是自由基。当这些帮助能量转换的自由基被封闭在细胞里不能乱跑乱窜时，它们对生命是无害的。,但如果自由基的活动失去控制，超过一定的量，生命的正常秩序就会被破坏，疾病可能就会随之而来。,自由基对人体的损害主要有三个方面：一、使细胞膜被破坏；二、使血清抗蛋白酶失去活性；三、损伤基因导致细胞变异的出现和蓄积。,导致各种肿瘤、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、肝损伤、以及中枢神经系统疾病等。,预防自由基伤害的方法：既然自由基不仅存在于人体内，也来自于人体外，那么，降低自由基危害的途径也有两条：一是，利用内源性自由基清除系统清除体内多余自由基；二是，发掘外源性抗氧化剂-自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。,大量研究已经证实，人体内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统，它包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等一些酶和维生素C、维生素E、还原性谷胱甘肽、胡萝卜素和硒等一些抗氧化剂。,酶的防御作用仅限于细胞内，而抗氧化剂有些作用于细胞膜，有些则是在细胞外就可起到防御作用。这些物质就深藏于我们体内，只要保持它们的量和活力它们就会发挥清除多余自由基的能力，使我们体内的自由基保持平衡。,要降低自由基对人体的危害，除了依靠体内自由基清除系统外，还要寻找和发掘外源性自由基清除剂，利用这些物质作为替身，让它们在自由基进入人体之前就先与自由基结合，以阻断外界自由基的攻击，使人体免受伤害。,许多水果、蔬菜对氧自由基有显著清除作用,Oneappleaday,keepdoctoraway,水果、蔬菜清除自由基的作用与它们富含抗氧化物质有关，如研究较多的维生素C、E、-胡萝卜素等。此外还有多酚类物质，类黄酮等。,抗氧化活性的测定,常见的测定方法:(一)自由基清除能力的检测方法1、ABTS自由基的清除能力2、DPPH自由基的清除能力3、羟基自由基的清除能力4、超氧阴离子自由基的清除能力5、氧自由基的清除能力(ORAC-OxygenRadicalAbsorbanceCapacity)6、总自由基捕获抗氧化参数法(TRAP),（二）脂质体系抗氧化能力的检测方法脂质过氧化(lipidperoxidation,简称LPO)是指脂类(LH)的多不饱和脂肪酸(PUFA)在自由基的引发下经酶促或非酶促作用,使其发生过氧化而生成脂质过氧化物的过程。,（三）抗氧化剂还原能力的检测方法1、铁离子还原能力(FRAP-Ferricreducing/antioxidantpowerassay）2、循环伏安法(cyclicvoltammetry,CV),详请参考：抗氧化活性检测方法的研究进展,Ferricreducing/antioxidantpowerassay（FRAP）,发明人：香港理工大学Prof.IrisBenzie,1996年发明，并于2001年取得美国专利，2006年瑞士日内瓦举行的第三十四届国际发明及创新技术与产品展览中，勇夺三项金奖、三项银奖及两项特别奖。,Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ),原理：,实验目的：1、掌握FRAP法测抗氧化活力的方法2、常见水果、蔬菜的抗氧化能力比较,实验内容：1、不同果、蔬抗氧化物质的提取2、FRAP测定方法操作3、抗氧化活力的计算,仪器、耗材：离心机、离心管、离心管，移液器、分光光度计、水浴锅、塑料比色杯、试剂瓶，吸水纸，枪头、量筒、大研钵,植物材料：苹果、草莓、芒果、青椒、番茄、胡萝卜,化学药剂：A、醋酸缓冲液：300mM，pH3.63.1g三水醋酸钠+16ml冰醋酸，溶解于1升水，贮存于4B、盐酸：40mM1.46ml浓盐酸稀释至1升，保存于室温条件下C、TPTZ（2，4，6-tri2-pyridyl-s-triazine）：10mM（使用当天配制）0.031gTPTZ溶解于10ml40mM盐酸中，50水浴溶解，贮存于50ml离心管中,D、三氯化铁溶液：20mM（使用当天配制）0.054g六水三氯化铁溶解于10ml双蒸水中E、亚硫酸铁标准液：1mM0.278g七水亚硫酸铁溶解于1升双蒸水中，-20保存F：甲醇500ml,实验方法：（1）FRAP试剂准备A、100ml醋酸缓冲液+C、10mlTPTZ溶液+D、10ml三氯化铁溶液+12ml双蒸水，混匀，37保温（2）2mlFRAP试剂+双蒸水1ml，4