基础生物工程大实验第一部分1

基础生物工程大实验,阎欲晓粟桂娇广西大学生命科学与技术学院2011.01,第一部分：酒精发酵大实验实验一双酶法制备淀粉水解糖实验二淀粉水解糖含量定量分析实验三酵母活化和游离酵母细胞发酵生产酒精实验四固定化酵母细胞发酵生产酒精实验五酒精蒸馏与酒精发酵液产物分析第二部分：生物工程基本设备实验六小型发酵罐的结构与使用,组织安排,1、每23人为一组（每班最多安排12组），自由组合，把组员姓名写在实验数据表上，讲课完后统一交给指导老师。每次实验结束前，向指导老师领取实验数据单，将实验数据填写上去，指导老师签名后才能结束实验。2、课前请做好预习，实验过程中要勤于思考，老师在指导实验过程中会随时提问；上课要准时，不迟到早退；未经指导老师批准擅自离开实验室，以旷课计；遵守实验室规章制度，每次做完实验要把本组台面收拾干净，用过的实验器皿清洗干净放好，养成良好的实验习惯。每次实验安排的值日生要认真做好实验场所的卫生工作，完成值日工作后报告老师，经同意方可离开。以上表现记入平时成绩，占40%；操作规范和熟练程度、实验报告成绩占60%。,组织安排（生技081）,指导老师：粟桂娇；阎欲晓助教：李才生物工程实验室老师：李小梅、莫祺红、黄熙,组织安排（生技082）,指导老师：粟桂娇；阎欲晓助教：丁猛生物工程实验室老师：李小梅、莫祺红、黄熙,每组织基本实验耗材,1瓶/组试剂有：0.1mol/LHCl；6mol/LHCl；6mol/LNaOH；DNS试剂；葡萄糖标准溶液(2.0mg/mL)；碘碘化钾溶液；0.1%酚酞指示剂；2%CaCl2溶液；500mL烧杯1个/组；洗瓶1个/组；6孔白瓷板1块/组；10mL移液管1支/组；10mL碱式滴定管；150mL三角瓶（活化酵母用）1个/组；150mL烧杯1个/组；6cm或9cm漏斗1个/组；滴定管架1台/组；100mL量筒1个/组；500mL三角瓶（配无菌水)1个/组；50mL三角瓶1个/组；精密pH试纸(pH2.74.7)(pH3.85.4)(pH0.55.0)(pH5.47.0)各1本/组；小试管筐1个/2组玻璃棒2根/组；250mL容量瓶2个/组；250mL烧杯2个/组；塑料滴管2支/组；铁架台（带铁圈、铁夹）2台/组；250mL三角瓶3个/组（其中1个用来配2%CaCl2溶液）；试管1.818cm20支/组0100红水温度计1支/组；可调电炉1台/组；石棉网1张/组,实验安全事项,灭菌锅、电炉、烘箱、水浴等高温避免烫伤浓硫酸、浓盐酸腐蚀性强避免烧伤玻璃器皿避免割伤,重视！,酒精发酵大实验,产品：酒精（乙醇）,用途,生产工艺,化学合成法,发酵法,英文名称：ethylalcohol;ethanol分子式：C2H5OH相对分子量：46.07,本实验主要以木薯淀粉为原料，采用游离酵母细胞和固定化酵母细胞发酵生产酒精。,1.学习并掌握淀粉双酶水解法制糖的原理及其操作工艺过程。2.掌握手持式折光仪测定糖含量的方法。,1双酶法制备淀粉水解糖,1.1实验目的,淀粉双酶水解法制糖的原理。手持式折光仪测定糖含量的原理。,1.2实验原理,目前，发酵工业所用的原料多以淀粉或糖质为主，而许多微生物并不能直接利用淀粉。淀粉必须经过水解制成淀粉糖以后才能被酵母菌等微生物所利用。工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的“糖化”，所制得的糖液称为淀粉水解糖或糖化醪液。本实验采用双酶法糖化制备糖化醪液，是以专一性很强的淀粉酶和糖化酶为催化剂，将淀粉水解为葡萄糖的方法。糖化醪液中主要的糖类是葡萄糖。,淀粉双酶水解法制糖的原理,（C6H10O5)n+nH2OnC6H12O6,酸或酶,淀粉的结构,支链淀粉,淀粉是由许多葡萄糖基团通过-1,4-葡萄糖苷键聚合而成或通过-1,6-糖苷键连接而成。,直链淀粉,还原末端,非还原末端,-1,4糖苷键,-1,6糖苷键,液化：-淀粉酶（工业上称为液化酶）作用于淀粉时，可以从分子内部切开-1,4-糖苷键，产生糊精、低聚糖和少量还原糖。,淀粉双酶水解过程包括液化和糖化两个步骤。,糖化：利用糖化酶将糊精及低聚糖水解为葡萄糖的过程。,淀粉水解速度主要与酶的用量、温度和pH值有关。酶催化反应对适合的温度和pH值要求很高。,手持式折光仪测定糖含量的原理,通过手持式糖度计测含糖量，可快速了解淀粉水解制糖的进程。,手持式折光仪，也称糖镜、手持式糖度计。,木薯淀粉，耐高温-淀粉酶（酶活2000U/g），糖化酶（10万U/g），1mol/LHCl，1mol/LNaOH等可调电炉，0100红水温度计，032手持式折光仪或080手持式折光仪，恒温水浴锅等500mL烧杯，玻璃搅拌棒，精密pH试纸，镜头纸，洗瓶,100mL量筒等,1.3实验材料与设备,1.4实验步骤,100g木薯淀粉,加水拌料(料：水=1：3）,加入-淀粉酶、CaCl2,调pH？,液化（温度？）,沸水浴蒸煮,冷却（温度？）,调pH？,加入糖化酶,糖化,降温，调pH,糖化液,量筒测量糖化液总体积V糖总（mL）,酒精发酵培养基（2瓶，120mL/瓶）,手持糖量计测糖化液的含糖量；DNS法测定还原糖和总糖浓度,1、记录手持式折光仪测得的糖含量，参照说明书进行温度校正。2、双酶水解制糖工艺中所选择的温度和pH的依据是什么？加入CaCl2有什么作用？3、目前常用的淀粉水解制糖的方法有哪几种？双酶法制糖的优缺点是什么？4、手持式折光仪测定糖含量的原理是什么？使用时有哪些注意事项？,1.5实验结果与讨论,讨论：淀粉水解糖中，主要成分是什么，另外还有哪些杂质？这些杂质中，哪些微生物能直接利用，哪些不能？,在淀粉水解糖液中，主要糖分是葡萄糖，另外，根据水解条件的不同，尚有数量不等的少量麦芽糖及其他一些二糖、低聚糖等复合糖类。除此以外，原料带来的杂质（如蛋白质、脂肪等）以及其分解产物也混入糖液中。葡萄糖、麦芽糖和蛋白质、脂肪分解产物（氨基酸、脂肪酸等）等是生产菌生长的营养物在发酵中易被各种菌利用；而一些低聚糖类、复合糖等杂质则不能被利用，它们的存在，不但降低淀粉的利用率增加粮食消耗，而且常影响到糖液的质量，降低糖液中可发酵成分。,1.5实验结果与讨论,讨论：淀粉水解糖的制备方法及比较,1.5实验结果与讨论,用于制备淀粉的原料主要有薯类、玉米、小麦、大米等富含淀粉的农产品。根据原料淀粉的性质及采用的催化剂不同，淀粉水解为葡萄糖的方法有酸解法、酶解法以及酸酶结合法等三种。,1、酸解法,又称酸糖化法，它是以酸为催化剂在高温下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。,1.5实验结果与讨论,2、酶解法,酶解法是在酶的作用下进行的，反应条件较温和，不需要耐高温高压或耐酸腐蚀的设备；酶作为催化剂的特点是专一性强，副反应少，故水解糖液纯度高，淀粉转化率高；可在较高的淀粉乳浓度下水解。如酸解法一般使用10-12Bx（含18%-20%淀粉）的淀粉乳，而酶解法可用2023Bx（含34%-40%淀粉）的淀粉乳，并且可以采用粗原料。用酶解法制得的糖液较纯净、颜色浅、无苦味、质量高，有利于糖液的充分利用。,优点,讨论：淀粉水解糖的制备方法及比较,1.5实验结果与讨论,2、酶解法,缺点,酶解法反应时间较长，设备要求较多，且酶是蛋白质，易引起糖液过滤困难。当然，随着酶制剂生产及应用技术的提高，酶解法制糖将逐渐取代酸解法制糖。,3、酸酶结合法,酸酶结合法是集中了酸解法和酶解法制糖的优点而采用的生产方法，它又可分为：酸酶法酶酸法,讨论：淀粉水解糖的制备方法及比较,1.5实验结果与讨论,4、淀粉水解糖制备方法比较,问题,说说酸水解法、酸酶法和酶水解法三种不同水解工艺的优劣？,从制得的水解糖液的粘度来看，以酶解法为最低，酸解法最高，如图所示。,讨论：淀粉水解糖的制备方法及比较,从水解糖液的质量、原料利用率、糖收得率、耗能及对粗淀粉原料的适应情况来看，以酶解法最好，其次是酸酶法，酸法最差。从淀粉水解的整个过程所需的时间来看，酸法最短，酶法最长。,掌握还原糖和总糖的测定原理，复习用DNS比色法测定还原糖的方法。,2淀粉水解糖含量定量分析,2.1实验目的,3,5二硝基水杨酸法（DNS法）定糖原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。,2.2实验原理,3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂；葡萄糖标准溶液（2.0mg/mL），6mol/LHCl，碘碘化钾溶液，6mol/LNaOH，1%酚酞指示剂等18mm180mm试管，移液管10mL，50mL三角瓶，滴管，白瓷板，250mL容量瓶，1001000L移液枪，蓝色枪头盒等恒温水浴锅，分光光度计等,2.3实验材料与设备,1、葡萄糖标准曲线制作分别配制0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mg/mL的葡萄糖标准溶液1mL，分别加入DNS试剂2.0mL，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0mL，摇匀，在540nm波长处测定吸光值OD540。（每组在此次实验过程中用同一支移液枪）测定前各台仪器均用蒸馏水调零，然后再测各管样液的吸光值。根据显色颜色由浅到深测定。在测定过程中请不要按自动校零键。注意分光光度计的规范操作。,2.4实验步骤,2.4实验步骤,以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。用Excel绘制葡萄糖标准曲线，显示方程和R平方值。,2、糖化液中含糖量的测定在测糖化液还原糖之前，先做预实验确定合适的稀释倍数（稀释倍数参考值：500倍)。注意取糖化液前要充分摇匀。具体操作步骤详见讲义。,2.4实验步骤,糖化液,还原糖,非还原糖,DNS法测定,2.4实验步骤,在测糖化液总糖之前，要先将糖化液中非还原糖完全水解成还原糖。,糖化液,还原糖,非还原糖,DNS法测定,还原糖,水解,总糖,具体操作步骤详见讲义。稀释倍数参考值：500倍。,1、用Excel绘制葡萄糖标准曲线，显示方程和R平方值。2、计算糖化液中还原糖和总糖的浓度，并与手持糖量计测定结果进行比较。分析影响双酶法制糖的因素有哪些？,2.5实验结果与讨论,3酵母活化和游离酵母细胞发酵生产酒精,学习和掌握酵母菌发酵糖产生酒精的方法熟悉游离酵母细胞发酵生产酒精过程和主要的工艺条件。,3.1实验目的,3.2实验原理,在工业酒精和各种酒类的生产中，酒精发酵作用主要是由酵母菌完成的。酵母菌通过EMP途径分解己糖（如葡萄糖）生成丙酮酸，在厌氧条件和微酸性条件下，丙酮酸则继续分解为乙醇并放出二氧化碳。,3.3实验材料与设备,250mL三角瓶，保鲜袋，十层纱布，恒温培养箱等。,在缺水的状态下，微生物会处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。酵母细胞所需要的活化时间一般需要1h左右。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。,1、酵母细胞的活化（下午操作）,实验具体操作过程：,活性干酵母1.0g,2蔗糖水30mL,复水活化12h,150mL三角瓶,30,培养箱,3.4实验步骤,2、游离酵母细胞酒精发酵,取活化酒母30mL,淀粉糖化醪液120mL,盖上一块10层纱布,蒙上一层塑料薄膜,包扎和扎眼,发酵48-72h,30,培养箱,接种,3.5实验结果与讨论,1、在用酵母菌进行酒精发酵时，为什么必须控制发酵液在微酸性条件下？2、为什么在纱布上蒙上一层塑料薄膜，并在塑料薄膜上用针尖轻轻扎几个小眼？3、培养过程中注意观察三角瓶中游离酵母细胞酒精发酵情况，对现象进行简单描述。,4.1实验目的1）了解固定化酶和固定化细胞的作用和原理；2）学习和掌握采用海藻酸钙包埋法制备固定化酵母细胞和利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的方法。,4固定化酵母细胞发酵生产酒精,4.2实验原理,固定化技术：将酶或细胞固定化的方法,包埋法,化学结合法(交联法),吸附法(载体结合法),将酶（或细胞）包埋在细微网格里,将酶（或细胞）相互连接起来,将酶（或细胞）吸附在载体表面上,固定化酶和固定化细胞的联系与区别,联系：应用相同，都能催化某些反应,区别：,1）固定化细胞技术操作容易，成本低，容易回收；,2）固定化细胞技术对酶活性影响更小；,3）固定化细胞固定的一系列酶；,4）由于大分子难以通过细胞膜，因此固定化细胞的应用有一定的限制；,4.3实验材料与设备,菌种：安琪牌酿酒活性干酵母固定化酶和固定化细胞常用的载体材料：明胶、琼脂糖、海藻酸钙、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等，其共同的特点是不溶于水的多孔性载体。,1、酵母细胞的活化,2、配制2%的CaCl2；无菌水等,3、配制海藻酸钠的溶液,4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合,5、酵母细胞的固定化,4.4实验步骤,6、接种和固定化酵母细胞酒精发酵,在缺水的状态下，微生物会处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。酵母细胞所需要的活化时间一般需要1h左右。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。,1、酵母细胞的活化（上午操作）,实验操作过程中要注意的下列问题：,活性干酵母1.0g,2蔗糖水30mL,复水活化12h,150mL三角瓶,30,培养箱,海藻酸钠溶液配制,海藻酸钠是一种天然多糖，主要由海藻酸的钠盐组成，由a-L-甘露糖醛酸(M单元)与b-D-古罗糖醛酸(G单元)依靠1,4-糖苷键连接并由不同GGGMMM片段组成的共聚物。分子式为(C6H7NaO6)x,分子结构如图所示：,加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及到实验的成败（注意：按照教材的