DNA 重组的载体.ppt

第二部分DNA重组的载体载体的三大功能：1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。2）为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合能力。3）为外源基因提供在受体细胞的的扩增和表达能力。,理想载体具备四个条件：1）具有对受体细胞的可转移性，提高导入细胞的效率。2)具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使外源基因在受体细胞中稳定遗传。具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，有利于外源基因的拼接插入。4)具有合适的选择标记（报告基因），便于DNA重组分子的检测。,一质粒载体(Plasmid)1质粒的基本特性1）自主复制性。具有自己的复制起始位点(Origing)(ori)和控制复制频率的控制基因及编码基因，形成独立复制子(Replico)结构。,2）可扩增性。严紧型复制质粒(Stringent)由宿主细胞内聚合酶III介导，为质粒上编码的蛋白因子正调控，蛋白因子极不稳定，每个细胞复制1-5个质粒拷贝。松弛型复制质粒(Relaxed)质粒复制需要半衰期长的聚合酶I；聚合酶，以及辅助的蛋白因子参与，合成减弱或完全中断时，质粒复制持续进行，具有高拷贝数30-50个。,当加入氯霉素抑制蛋白质生物合成，阻断宿主菌代谢途，而松弛型复制质粒利用丰富原料及能量大量复制，每个细胞积累上千个DNA分子。这个过程依赖质粒上基因产物与蛋白因子相互作用。3)可转移性在天然条件下，野生型质粒通过细菌接合作用从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。,4）不相容性相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称质粒的不相容性。a)两种不同质粒同时进入受体细胞，两者复制的起始频率随机.b)分裂前夕的拷贝数不均等，经过若干次细胞分裂后必然导致，两种不同质粒的独占性。选择标记的插入失活,插入失活,2质粒的改造与构建1）删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段装载量。2）灭活某些质粒的编码基因。3）加入易于识别的选择标记基因。4）选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列-多克隆接头.(Polylinker)5）加入特殊的基因表达调控元件。载体的质粒构建过程图3-1，图3-2,金属硫蛋白突变体基因-在蓝藻中克隆一简介1-小鼠金属硫蛋白突变体结构域二聚体-，对重金属有强结合能力。2PpSbA强启动子，在叶绿体，大肠杆菌，蓝藻中强启动功能3pRL-中间载体，突变体与强启动子相连.4PDC-穿梭表达载体，5PCC7120鱼星藻目的：构建穿梭表达载体，含有强启动子，金属硫蛋白突变体基因，在蓝藻中表达。表明：转基因藻具有吸附金属的能力。,穿梭表达载体的构建1人工合成两引物，5-GAGAATTCATTCATGTGCTGCTCCTGCTGCTGT-3BamHl5-CTGGATCCTCAGGCACAGCAAGTGCAiGCA-3E.coR1与PG2A进行PCR，得到突变体基因，两端含有E.coR1和BamH1双酶切位点。,2.RL-439中间质粒。被E.CORI和BamHI双酶切.(12)两者T4-连接酶连接，-基因定向克隆到强动子PpSbA之后.4.PpSbA强启动子，在叶绿体，大肠杆菌，蓝藻强启动功能5.穿梭表达载体的获得1)中间载体PRI-,穿梭表达载体pDC-08用EcoRI酶切2)T4-DNasa相连,3)用EcoRI酶切载体,鉴定。,6.三亲结合转移与筛选，7.转化子鉴定。8.蛋白质印迹鉴定.,图1愈伤组织小块接种于不同比例的激素中，待分化。,图2愈伤组织已长成。,3质粒的分类及用途1）克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。2）测序质粒：a)高拷贝复制，便于DNA片段克隆和扩增。b)含多酶切口的接头片段，在接头片段两端邻近区域，设有两个不同的引物序列，重组质粒变性后即可测序。3）整合质粒：含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列，克隆在整合质粒上的外源基因进入受体细胞后，准确重组整合在染色体的特定位置上。,4）穿梭质粒a)分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构及相应选择标记基因，因此能在两种不同种属的受体中复制并检测。大肠杆菌-链酶素穿梭质粒，大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒。b)克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载体直接从一个受体菌转移至另一个受体菌中复制并遗传。,5）探针质粒a)设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子，终止子。b)装有定量检测表达程度的报告基因，（抗生素的抗性基因）c)缺少启动子，终止子，载体本身不能表达报告基因d)当含有启动子，终止子的DNA片段插入合适的位点，报告基因才能表达。e)表达量的大小直接反应被克隆基因的表达调控元件的强弱。,6）表达质粒a)在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转录效率较高的启动子，合适的核糖体结合位点（SD序列），终止子结构。使得克隆在合适位点上的任何外源基因都可在受体细胞中,高效表达。大肠杆菌常用启动子：Lac,Tac,Trp,和来自噬菌体强启动子PL,PR。它们由大肠杆菌RNA聚合酶识别起始.,来自T7噬菌体的T7启动子。必须由T7噬菌体来源T7RNA聚合酶识别起始转录。d)表达载体用T7启动子必须用能产生T7RNA聚合酶的受体菌株JM109,BL21(DE3)。e)PSPORT系列和pSP系列。,4.实验室常用大肠杆菌载体质粒大小(Kb)选择标记克隆位点功能pBR3224.36Ap,TcBamHI,PstI,EcoRI克隆载体pGEX4.9Ap,LacPstI,MluI,EcoRV次级克隆载体Ap,Iac,NarV酶解作标准分子量pKK233-24.6Ap,TcSalI,BamHI,表达型NcoI位点提供PstI,NcoI,EcoRI翻译启始密码子pSP722.6ApXhoI,PstI,BamHI表达型,携有-HidIIIEcoRV双向T7,Sp6启动子pSPORT14.11Ap,LacopzEcoRI,SalI,Pst表达型携有BamHI,HidIII双向T7,Sp6启动子pUC18/192.69Ap,LaczEcoRI,HidIII测序载体,KpnI,BamHI次级克隆载体,5.,质粒的纯化1.碱裂解法a)溶菌酶破细胞壁；b)SDS-NaOH混合液去细胞膜，释放细胞内含物；c)高浓度醋酸钾沉淀染色体，去除染色体DNA和蛋白质；d)苯酚-氯仿灭活核酸酶，去除蛋白质；e)乙醇沉淀水相质粒；f)用Rnase降解RNA。优点：质粒纯净。缺点：存在一定比例开环结构。,2.沸水法a)用牙签挑取固体培养基的菌体，b)悬浮在EDTA,Triton-100,溶菌酶缓冲液，c)沸水中30-40s，d)离心，挑去沉淀物，e)乙醇沉淀水相质粒DNA。优点：速度快200个克隆/每天，缺点：纯度不高。3.由于空间结构不同，电泳条件下迁移率顺序:cccDNAL-DNAOC-DNAD-DNAT-DNA经限制性内切酶处理，所有结构都为直线性分子。,电泳方向V|T-DNA-|D-DNA-|OC-DNA-VL-DNA-Ccc-DNA-对照酶切质粒DNA酶切图谱示意,图2-4DNA酶解后的电泳图谱1234567,3.氯化铯密度梯度离心法氯化铯EtBr（溴化乙啶）a)细菌裂解及分离过程中染色体易断裂为线性分子b)质粒DNA分子量小，结构紧密，保持环状。c)溴化乙啶插入线性DNA多，密度低。石蜡油层蛋白质缺口环状和线性DNA闭环质粒DNARNA,二入-双链噬菌体入-噬菌体生物学特性：是大肠杆菌温和型噬菌体，由头部外壳蛋白和48.5kb双链DNA组成，入-DNA两端各有一个12碱基组成互补单链,称cos末端，cos末端将DNA引入头部结构。大肠杆菌宿主细胞裂解释放噬菌体颗粒，噬菌体颗粒又感染附近大肠杆菌,形成新一轮裂解周期，入-噬菌体悬浮液加到大肠杆菌液体培养基，37C培养6小时，培养液由混浊变澄清，说明大肠杆菌完全被裂解。,噬菌斑A.入-噬菌体悬浮液加到大肠杆菌，和琼脂糖固体培养基，37C过夜。B.固体平板培养基出现透明斑点（噬菌斑）.噬菌斑是经过若干裂解周期形成宿主菌死亡区域。同体培养基限制，透明圈外围大肠杆菌仍能生长.一个噬菌斑中有上百万个噬菌体颗粒，均由一个噬菌体无性繁殖所产生的，是入-噬菌体DNA用于分子克隆的基本原理。,三入-双链噬菌体载体入-DNA通过噬菌体特异性感染高效进入宿主细胞或受体细胞，b)入-DNA在大肠杆菌中高拷贝复制，c)噬菌体的头部空壳蛋白对入DNA的包装与其序列无关,只识别COS位点。d)在分子克隆早期就被选作载体使用。,1重组体分子的体外包装1）把带有目的基因的外源片段插入载体，导入寄主细胞。直接感染大肠杆菌，转染（transfection）形成噬菌斑。2）体外包装，把重组体分子包装为成熟的噬菌体颗粒，再导入寄主细胞。,3）入-DNA包装入-噬菌体头部前体结构a)头部空壳蛋白可包装最大限度51Kb,大于51Kb头部包装不进去，最小限度38Kb，小于38Kb噬菌体颗粒无侵染性。包装限度是入-DNA总长的75%-105%(38Kb，51Kb)b)野生野生型入DNA长度为48Kb，其中40%，约20Kb对整合，切割极其重要。c)野生型入DNA基因组中编码必要基因的DNA区段约占20Kb.d)带目的基因的外源片段入DNA载体极限约23Kb.,2野生型入DNA载体的构建1）缩短长度，提高外源DNA片段的有效装载。入DNA中部重组整合区占入DNA的40%（19.4Kb），缺失不影响入DNA复制与裂解周期，可重组改造。改造后带目的基因的外源片段入DNA载体极限23Kb2）删除重复的酶切位点。a)野生型入DNA有重复酶切位点，5个EcoRI，7个HidIII.b)引入多酶切口接头。,3）灭活与裂解周期有关基因。a)野生型入DNA经改造后在所有大肠杆菌内进行繁殖，极易扩散传播，重组体分子的性质，对生物体或人才类带来危害。将无义突变引入裂解周期有关基因内，这种入DNA在的少数大肠杆菌菌株中繁殖（K12）大肠杆菌K12在蛋白质合成时纠正无义突变。,4）引入选择标记基因。LacZ，（基因片段来自大肠杆菌）a)蓝色噬菌斑入DNA载体编码-半乳糖苷酶N端前146个氨基酸与大肠杆菌宿主表达的-半乳糖苷酶C端肽段互补（-互补）形成全酶，酶将5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal)降解,成为蓝色产物,淡蓝色噬菌斑。b)无色噬菌斑重组外源基因插入后将酶灭活，重组噬菌体形成无色噬菌斑。,CI+标记基因，溶源状态，混浊噬菌斑透明（重组）。CI+基因编码CI阻遏蛋白，CI基因突变的入-噬菌体形成透明噬菌斑。a.入DNA载体携带含有EcoRI切点的CI+标记基因，b.这种载体进入高频溶源化突变的大肠杆菌内，建立溶源状态，形成混浊噬菌斑,(溶源细胞比未感染的细胞生长慢）c.当外源基因插入到CI+标记基因EcoRI位点时，导致CI+基因灭活，重组噬菌体，因不能建立溶源状态而形成透明噬菌斑。,Spi+(P2干扰敏感性)，1.野生型入噬菌体在P2噬菌体溶源化的大肠杆菌中不能进入裂解周期，称干扰敏感性。（不形成噬菌斑）但缺失重组基因red,gam的入噬菌体在P2噬菌体溶源化的大肠杆菌将不受影响，裂解溶源菌正常繁殖而形成噬菌斑。3.外源重组基因插入与载体某一片段缺失同时发生缺失片段含有red,gam基因.（即red,gam基因缺失）凡是重组入噬菌体呈现Spi表型即裂解溶源菌形成噬菌斑,2入DNA分类及用途a)插入型载体：改造后入DNA载体长度正好为包装下限，称插入型载体。允许外源DNA插入片段0-14.5Kb。b)取代型载体:入DNA长度40Kb，在非必需区含两个相同酶切口，之间距离14Kb，去除这14Kb用外源DNA片段取而代之。1)Charon系列设计克隆外源DNA大片段的取代型载体,2)EMBL系列设计克隆外源DNA大片段的取代型载体。优点：便于将外源DNA片段从重组体分子上切下。3)入-DASH系列含有方向互为相反的两套多克隆位点接头序列，优点:便于多种外源DNA大片段的取代重组。4)入-gt系列插入型表达载体可用来克隆表达外源c-DNA，优点:载体上温度敏感型阻遏物,用来控制复制及融合蛋白的表达。,3入DNA的纯化含有乳糖和MgCI的LB培养基上培养大肠杆菌，至对数生长期。2)加入合适滴度入-DNA噬菌体悬浮液，（已包装好含外源DNA），371h。新鲜LB培养基稀释培养物。培养4-12h，噬菌体颗粒达1013/L-1014/L。4.加入固体NaCI和PEG-800，高速离心沉淀噬菌体颗粒5.蛋白酶K处理噬菌体悬浮液，苯酚-氯仿抽提，释放入DNA。6.乙醇沉淀DNA。,此法抽提入DNA纯度不高，含染色体DNA，程序简单。第4）改用CsCI密度梯度离心,获得高纯入DNA样品。三.M13单链噬菌体载体1.单链环状性丝状噬菌体，特异性感染含性散毛结构的大肠杆菌。2.M13DNA所有基因都是必需的，不能删除。,3.通过定点诱变，插入片段进行改造。1）通过定点诱变，封闭重复酶切切口。2）引入选择标记基因：启动子，操作子，-半乳糖苷酶氨基端编码序列（LacZ）的操纵子片段（Lac）组氨酸（his），抗生素抗性基因3）人工合成多克隆位点接头片段插入标记基因内部，含重组子噬菌斑呈白色，含载体DNA的噬菌斑呈蓝色。4）多克隆位点接头片段两侧改为统一测序引物序列，分离的重组分子的单链形式直接用于测序。,四噬菌体-质粒杂合载体噬菌体特征区域与质粒重组，具有优良性能。1考斯质粒（Cosmid）1)入-DNA的cos区与质粒DNA重组，2)入-DNA装载量23Kb，3)入-DNA包装蛋白识别cos信号，与包装性质无关，用质粒取代入-DNA，大幅度提高外源DNA装载量。4)入-DNA-cos位点及附近区域1.7Kb质粒3.3Kb。构成考斯质粒共5Kb,5)最大装载量45.9Kb（50.9-5Kb）。,2.噬菌粒载体丝状噬菌体DNA复制起始点序列与质粒组成杂合子。1）具有质粒基本性质，便于外源DNA克隆及筛选。2）提高外源DNA装载量，一般载体分子小其装载量大。3）M13DNA重组分子在复制时易发生DNA缺失，噬菌粒重组分子则相对稳定。4）常使用的噬菌粒载体pGEM-3Zf3.2KbpUC118/pUC1193.2KbpZ2584.9KbpEMBL4.0Kb,五动物病毒载体1特点：向真核细胞运载目的基因，动物病毒是理想基因工程载体。1）整合性感染是病毒核酸整合到细胞染色体上，随复制而扩增。2）序列中具有很强启动子，病毒感染细胞有大量拷贝高效表达3）在感染细胞中提取病毒比细菌中提取质粒更好。,2.杆状病毒载体（AcMNPV裂解病毒）是昆虫表达系统。1）杆状病毒表达体系用于真核细胞内蛋白质修饰，加工，转运.2)AcMNPV是非辅助性病毒。3)使产物呈溶解状态。4)基因很大（130Kb），克隆大片段的外源基因。5)不感染脊椎动物，启动子在哺乳动物细胞内无活性。6)用于毒性蛋白质，癌基因表达，优越，可靠。缺点：昆虫细胞培养周期长，技术较难掌握。,3.痘苗病毒载体痘苗病毒(Poxvirus)是动物病毒中最大一类痘病毒。载体三个成分：1.调控序列，2.可插入外源