9 第9章 酶免疫技术.ppt

第九章酶免疫技术,第一节酶免疫技术的特点一、酶和酶作用底物二、酶标记抗体或抗原三、固相载体,第二节酶免疫技术的分类一、均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验一、基本原理二、方法类型及反应原理,思考题小结,放射免疫技术,发光免疫技术,酶免疫技术,三大经典标记技术,三大经典标记技术,第一节酶免疫技术的特点,主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,原理及特点,特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。,原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理及特点,标记酶的要求：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉,一、酶和酶作用底物,辣根过氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心,纯度用RZ(纯度数)值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD(吸光度)值之比,RZ值与酶活性无关，酶活性单位U比RZ值更为重要,ELISA中应用最为广泛的标记用酶,常用酶,酶和酶作用底物,优点,容易提取价格低廉性质稳定，耐热，与抗原抗体偶联后活性很少损失,碱性磷酸酶（AP）,菌源性AP肠粘膜AP,半乳糖苷酶（-Gal）,用于均相酶免疫测定,常用酶,酶和酶作用底物,HRP的底物,DH2+H2O2D+2H2O,HRP,供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种,H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高,常用底物,酶和酶作用底物,HRP的常见底物,邻苯二胺OPD,四甲基联苯胺TMB,5-氨基水杨酸5-ASA,2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS,常用底物,酶和酶作用底物,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。,TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,HRP的常见底物,酶和酶作用底物,AP的底物,-Gal的底物,对-硝基苯磷酸酯（pNPP）,4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷（4MUG）,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。,酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。,常用底物,酶和酶作用底物,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物（conjugate）酶标记物,通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物,二、酶标记抗体或抗原,抗原要求纯度高，抗原性完整,抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。,制备方法要求,酶标记抗体或抗原,制备方法要求,技术方法简单、产率高，重复性好,标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性,酶标记物稳定，不形成聚合物,酶标记抗体或抗原,制备方法,过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原,戊二醛交联法,酶标记抗体或抗原,戊二醛交联法,戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。,酶标记抗体或抗原,纯化及鉴定,标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度,常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯,酶标记抗体或抗原,固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法,固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面,三、固相载体,要求,结合抗体或抗原的容量大抗体或抗原牢固地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济,种类,塑料制品微颗粒膜载体,固相载体,将抗原或抗体结合于固相载体,用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附,包被coating,封闭blocking,包被与封闭,第二节酶免疫技术分类,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均相,非均相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,组织切片或其它标本中抗原的定位,液体标本中抗原或抗体的定性和定量,用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定,酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。,原理,一、均相酶免疫测定,最具代表性的两种技术,酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique,克隆酶供体免疫分析CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay,均相酶免疫测定,EMIT示意图,CEDIA示意图,分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定,与均相不同之处,需分离游离与结合的酶标记物,二、非均相酶免疫测定,第三节酶联免疫吸附试验,底物显色定性或定量的分析,原理,包被,反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体,洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离,1,2,3,4,一、基本原理,固相的抗原或抗体,酶标记物（酶结合物）,酶反应的底物,三个必要试剂,二、方法类型及反应原理,双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等,ELISA检测抗原的方法,1、已知抗体包被于载体表面,3、加酶标抗体与抗原结合,4、加酶作用的底物产生颜色,2、加待检物抗原与抗体结合,4、加酶作用的底物不产生颜色,双抗体夹心法测抗原,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待检物无抗原与抗体结合,3、加酶标抗体无抗原结合,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）,ELISA检测抗原的方法,竞争法测抗原,+,-,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合,3、加酶作用的底物不显色或显色弱,3、加酶作用的底物显色,1、已知抗体包被于载体表面,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合,间接法方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定,ELISA检测抗体的方法,1、已知抗原吸附于载体表面,2、加待检物无抗体与抗原结合,3、加酶标抗Ig与抗体结合,4、加酶作用的底物产生颜色,1、已知抗体吸附于载体表面,2、加待检物有抗体与抗原结合,3、加酶标的抗Ig抗体,4、加酶作用的底物不产生颜色,间接法测抗体,-,Y,E,Y,+,双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体,ELISA检测抗体的方法,竞争法原理：类似检测抗原的竞争法应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测,ELISA检测抗体的方法,捕获法应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体甲型肝炎HAV-IgM抗体乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体,ELISA检测抗体的方法,捕获法,原理：抗人IgM链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色,捕获法原理,+,-,1、固相化抗人IgM,1、固相化抗人IgM,2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，与特异性抗体结合,4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色,2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合,4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色,第四节酶免疫测定的应用,均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。,1酶免疫技术的要点？2酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4常用的底物有哪几类？特点？5常用的酶有哪几类？特点？6何谓包被与封闭？其作用？7常用固相载体的种类和特点？8举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。9ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？10对酶免疫技术的应用评价如何？,思考题,酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用