11 蛋白质(酶、抗体)标记1.ppt

第十一章标记,标记的概念指以共价键的方式将放射性元素（如3H、14C、32P、35S、125I）或非放射性物质（如地高辛、生物素、酶、荧光素）结合到某些生命物质（如DNA、RNA、寡核苷酸、抗体、抗原及某些小分子物质）上的过程标记技术已在序列测定、分子杂交、免疫分析等领域得到广泛应用；主要用于生命物质的定性、定量由示踪物和被标记物构成的复合物称为探针或某物的标记物,第一节核酸标记,核酸标记是指能与特定核酸序列（靶序列）发生特异性互补（杂交），并含示踪物的已知核酸片段（DNA或RNA）,一、标记物的制备及类型,20C，70Y磷酸化法切口平移法广泛用于分子克隆过程；缺点：,只能在核酸的5端引进一个放射性原子，会限制探针的比活度探针含有模板DNA双链序列片段，在某些情况下，探针的互补链会竞争靶DNA与探针的结合,20C，80Y中期体外转录RNA探针法此法合成效率高，不需分离模板DNA，但应避免RNase污染,(一)制备方法,(二)核酸标记类型(同位素)核素标记通常采用的同位素有32P、33P、35S，其中32P活性强，信号比较好放射性探针与固相载体上的靶核酸杂交后，洗涤除去未杂交的探针，再通过X-射线衍射和放射自显影检测分析结果（但此法须在特殊实验室进行，防止同位素伤人）非同位素标记以生物素、地高辛和荧光素等非核素为示踪物，采用发光法或生色法检测（此法灵敏度与核素标记相仿，但无核素污染问题，已成为标记技术的发展趋势）,二、非核素标记,生物素、地高辛等非放射性示踪物都很容易掺入到DNA或RNA中制成核酸探针。其信号可采用荧光染料、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶直接与生物素偶联，或用荧光染料、碱性磷酸酶与抗地高辛抗体偶联进行检测此法标记量足（一次反应可标记数mg），稳定性好（有效期可达2年）,（一）地高辛（DIG）,1.双链DNA探针标记随机引物介导法随机引物：不均一的寡核苷酸混合物（612核苷酸单链DNA）模板：单链DNA酶：DNA-pol（klenow片段）合成原料：dNTP混合物标记物：Dig-dUTP其他试剂,随机引物介导法是将线性DNA模板上多处与随机引物杂交，在DNA-pol的催化作用下，新链中掺入DIG-dUTP,从而提高标记的灵敏度（高效、高灵敏度）试剂及操作（课本）,切口平移法,原理：当双链DNA分子的一条链有切口时，E.coli-DNA-pol可将核苷酸残基（如Dig-11-dUTP）加到切口处的3-OH端；又由于该酶具有53外切酶活性，所以它可从切口的5端除去核苷酸。5端除去和3端加入核苷酸同时进行，导致切口沿着DNA模板链移动,2.单链DNA探针制备,单链DNA探针的优点不存在互补双链，避免了DNA双链在重新复性时形成无效杂交体的可能性方法,合成可克隆于噬菌粒或M13噬菌体载体上的DNA片段，并以其作为模板合成与其互补的探针（为DNA）将克隆于特定载体（带有可被噬菌体依赖于DNA的RNA-pol识别的启动子）上的靶序列转录成RNA探针；再在反转录酶的催化作用下制备cDNA探针方法需分离探针和未标记的核酸，而方法只需用不含RNase的DNase降解即可；故克隆DNA片段的体外转录法是合成单链DNA探针的较好方法,3.PCR合成DNA探针,第一次循环之前于95变性7min，随后每次循环的条件是：95变性45s，60退火1min,72延伸2min（一个循环）用PCR法制备的DIG探针灵敏度高（即使含有很少量的副产物，也会明显影响杂交的特异性；所以在杂交之前，要用凝胶电泳纯化探针），数量大,4.寡核苷酸探针的制备,用DIG-11-ddUTP制备寡核苷酸探针，制备出来的探针有3端-、5端-寡核苷酸标记和3-端尾部寡核苷酸标记之分,（1）3端-寡核苷酸探针,（2）3-端尾部寡核苷酸探针,在寡核苷酸3-端加上10100个碱基的尾巴。可提高探针的灵敏度在标记过程中，末端转移酶可将DIG-11-dUTP加到寡核苷酸的3-尾端但探针的尾巴加长，可能会产生非特异性反应。所以在杂交之前，通过一竞争序列（如polyA序列等）“预杂交”，或者改变设计条件等措施可降低非特异性反应（如P201“b”）,（3）5端-寡核苷酸探针,在合成待标记寡核苷酸至最后一步时，按固相氨基磷酸盐法，使5端氨基化，将用氨水处理载体释放的寡核苷酸与DIG反应制成标记于5端的寡核苷酸探针,5.RNA探针的制备,采用体外转录法制备先克隆合适的模板DNA到相应的转录载体（如噬菌体）将得到的重组DNA线性化RNA-pol催化核苷三磷酸在强启动子下游固定位点开始转录，并将修饰的核苷酸（如DIG-UTP）掺入到RNA链中，从而获得具有一定长度和较高活性的RNA探针（每2025个核苷酸可结合一个DIG-11-UTP）,（二）生物素,用生物素标记的探针与靶核酸杂交后，探针上的生物素能与链霉菌亲和素（或称链霉菌白蛋白）-酶直接结合，亲和素与生物素的结合力强（结合常数）；这类蛋白质有4个结合生物素的位点，所以它既可与酶标记的生物素结合，又可以与探针中的生物素结合,1.切口平移法制备生物素酰化的探针,此法采用生物素-11-dUTP制备探针，每1kbDNA可掺入约50个生物素分子,2.随机引物介导法制备生物素酰化探针,（三）两种新标记法,扫若仑标记和分子灯塔探针,1.扫若仑标记,扫若仑（psoralen）是一种天然的三环化合物，其带有胺活性基团衍生物可用来标记多种核酸（如DNA、RNA、PCR产物和寡核苷酸等）。用其制成的探针灵敏度高（可达fg级别）扫若仑标记为非酶促反应，是用波长320400nm的紫外光照射，引起光循环反应，使带胺基的扫若仑以三环平面形式插入核酸分子，并以共价键结合形成探针，DNA和RNA时，共价键结合的位置分别在dT和U处；探针中扫若仑衍生物的含量与核酸中胸苷（dT）或尿苷（U）的含量成正比关系,2.分子灯塔探针,概念用新的非核素化合物标记，用于检测特别序列核酸的核酸探针特征,由25个核苷酸组成灯中间环形的15个核苷酸与靶DNA是互补序列；灯竿一端的5个核苷酸与另一端的5个核苷酸是互补在5和3端分别耦合一种荧光素（发光剂）和非荧光素（熄灭剂）,分子灯塔探针的熄灭剂可吸收发光剂发射的能量。在室温条件下，分子灯塔的构型可确保发光剂和熄灭剂紧密互补结合，致使荧光基团处于熄灭状态，无荧光产生；一旦当灯塔探针的15个核苷酸与靶DNA或RNA序列杂交时，其发光剂和熄灭剂便相互分离，产生荧光,三、核素标记,标记核酸的核素有32P、33P、35S和3H。其中32P是制备高比活度放射性探针常用的一种同位素；33P比32P使用安全；35S能量低，不会引起核酸损伤，常用于制备稳定的比活度低的探针，但对许多酶的活性有影响；3H标记的探针常用于原位杂交、核酸的合成和降解分析由于不同放射性同位素对人体伤害和环境污染程度不同，因此实际操作时根据检测要求结合实验室条件选择相应的标记方法,（一）双链DNA探针,1.切口平移法原理类似于非核素DIG标记中的切口平移法，所不同的是，此处用高放射活性标记的核苷酸置换原来的核苷酸操作要点将DNase和E.coli-DNA-pol催化的反应分开进行，这样可避免DNase在聚合反应过程中降解DNA,2.随机引物介导法,方法与DIG-随机引物介导法制备DNA探针相似，即用DNase水解小牛胸腺DNA（或鲑鱼精DNA），产生612核苷酸的单链DNA或随机6聚合体核苷酸的混合物作为引物；以变性的闭环DNA或线性DNA作为模板，在klenow片段的催化作用下，介导产生DNA探针分为游离DNA片段为模板和固定DNA片段为模板制备探针,（1）以游离DNA片段为模板制备探针,模板DNA用限制性内切酶消化，电泳纯化或乙醇沉淀后，与其他试剂混合制备探针,（2）以固定DNA片段为模板制备探针,DNA经电泳后，用EB染色，切下DNA色带，加水后沸水浴使其变性，然后37（固定），再加其他试剂室温或37制备探针,（二）RNA探针的制备（体外转录法）,四、标记物纯化,标记物纯化就是除去未标记的同位素或非同位素产物并非所有探针都需纯化，通常用于膜杂交的探针不需纯化，而用于原位杂交的探针则需要纯化。常用的纯化方法有萃取/沉淀法、层析法、离心法和电泳法等,（一）EtOH沉淀法,加1l糖原溶液（20mg/ml）到含探针的试管中，混匀加23倍体积冷EtOH，低温沉淀，离心分离沉淀，并用少量70%冷EtOH洗涤干燥的沉淀物溶于TE缓冲液中，低温贮存,（二）层析法,SepharoseCL-4B柱层析层析结果用PAGE检测SephadexG-50或G-25柱层析,五、探针的鉴定,主要鉴定探针的长度、示踪物的掺入率及特异性（一）杂交法,用靶DNA或RNA鉴定探针的特异性根据示踪物的性质，采取相应方法（如荧光、化学发光、酶联免疫等）检测其含量根据凝胶电泳Rf值检测探针长度,（二）酸沉淀法,主要用于测定放射性核素标记的探针，检测放射性核素的掺入率。原理：先用强酸（如冰乙酸）沉淀探针（与前体dNTP、NTP分离），再测定其放射性强度；根据放射性强度计算放射性核素的掺入率,（三）色谱法,如用DIG标记的探针其酯溶性增强，可用RP-HPLC分离检测?,（四）比色法,根据标记物在某条件下能呈色的性质，采取相应的显色剂显色后，比色,（五）发光法,先用紫外照射法将靶DNA交联到膜（如尼龙膜）上，再使探针DNA或RNA与交联到膜上的DNA杂交，封藏，至暗室中暴光，用合适的X线片接收，并用图像仪对印记斑点进行扫描,第二节蛋白质(酶、抗体)标记,通常抗体与抗原、酶与底物、激素与受体等物质之间发生的特异反应，其结果通常不能从检测仪上直接读出或者用肉眼查觉，一般都需要借助发色、发光试剂，或者同位素、酶试剂标记产生具有高度专一性的探针来判断,目的,掌握蛋白质的常见标记物的种类及标记方法掌握核素和非核素标记,一、标记方法,抗体（IgG）或蛋白质的标记方法包括酶标记、荧光标记、生物素标记、有色金属标记等,1、酶标记,常用于标记抗体的酶,辣根过氧化酶(HRP),碱性磷酸酶(AKP),半乳糖苷酶(galactosidase),由抗体-酶制成的偶联体(或称特异性探针)的用途：,ELISA、免疫印迹、细胞和组织化学免疫染色,(1)辣根过氧化酶(HRP)抗体偶联,A过碘酸盐(periodate)法,B戊二醛(glutaricdialdehyde)法,原理：HRP是一种糖蛋白，糖链部分无活性，其己糖邻位-OH可被碱性过碘酸盐氧化成醛基，并与IgG中游离-NH2共价结合成HRP-IgG偶联物。此酶标抗体可直接使用，或凝胶过滤纯化后使用（是制备酶标抗体的有效方法）,原理：先将戊二醛偶联到HRP，用凝胶过滤除去多余的戊二醛，再与IgG偶联；制成的的HRP-IgG偶联物需纯化分离后使用,(2)碱性磷酸酶(AKP)抗体偶联,原理：戊二醛一步法，即通过戊二醛将AKP与IgG偶联成酶标抗体此法偶联效果好，酶活性较高；但偶联时需用高浓度的酶和抗体；成品需在有抑菌剂（如NaN3等）存在的条件下保存,(3)半乳糖苷酶抗体偶联,A戊二醛一步法将IgG与-半乳糖苷酶按一定比例溶解于PBS溶液中，透析后加入戊二醛偶联,BMBS法MBS（间位-马来酰胺苯-N-羟基琥珀酰亚胺酯）为一种双功能试剂，可连接带-NH2或含-Cys的蛋白质。由于IgG不含-Cys，故先让MBS与IgG的游离-NH2偶联，经透析除去游离的MBS后，IgG-MBS再与-半乳糖苷酶偶联,(4)HRP与抗-磷酸酪氨酸抗体偶联,是将HRP偶联到抗-磷酸酪氨酸抗体上，制成的酶标抗体；可直接检测蛋白质酪氨酸磷酸化情况,2、荧光染料标记,常见的荧光染料荧光素(nuorescien)、罗丹明(rhodamine)、德克萨斯红(texasred)、藻红朊(rhycoerythrin，PE)、四甲基罗丹明(tetramethylrho-damine),荧光染料标记的优点标记抗体或蛋白质后会增加发色强度、缩小波长范围，为直接观察创造了条件,(2)二氯三嗪基氨基荧光素（DTAF)-抗体偶联,(3)CyDye荧光染料-抗体偶联特点：荧光染料可直接与二抗偶联，不需要反应底物CyDyeULS标记的核苷酸和切口转移试剂盒，使用CyDyeTM荧光染料可以直接标记PCR产物,采用荧光染料制备荧光素-抗体偶联的探针的方法,(1)异硫氰酸盐衍生物-抗体偶联异硫氰酸荧光素（FTTC）、罗丹明异硫氰酸盐和四甲基罗丹明异硫氰酸（TRITC）,3、生物素标记,生物素标记的特点蛋白质(如酶和抗体)与小分子生物素偶联后，并不会改变其生物活性，反而可提高检测灵敏度,(1)生物素标记抗体,一般先将生物素制备成生物素琥珀酰亚胺酯（可直接购买），然后与IgG按一定比例反应标记,(2)生物素标记蛋白质,常用于标记蛋白质的生物素衍生物及标记原理生物素-羟基琥珀酰亚胺（BNHS）在碱性条件下，可将生物素与蛋白质的-NH2偶联；也可用于标记抗体、激素，或其他含Lys残基的多肽。此法制备的标记物稳定，标记效率高生物素马来酰亚胺适用于含Lys残基或含-SH的蛋白质的标记马来酰亚胺通过提供间隔臂使生物素与蛋白质结合生物素肼通过碳二亚胺（缩合剂）将生物素标记到蛋白质或肽的Asp或Glu的-COOH上,生物素标记蛋白质的操作试剂：生物素酰氨基己酸N-羟基琥珀亚胺酯；间隔臂-氨基己酸操作：所有的试剂要在用时配制，生物素衍生物是溶在重蒸的DMF（二甲基甲酰胺）或DMSO（二甲亚砜）,4、金标记,原理,借助金粒的电子密度特征，用其与抗体偶联后，可成功地置显微镜下观察胶体金颗粒,分类及用途,一般分为三种：5nm、l0nm和20nm5nm粒子容易渗透到细胞膜，使细胞间染色，适用于电子显微镜准确定位抗原l0nm粒子较大，可使细胞表面染色，适用于光学显微镜观察20nm粒子可用于免疫印迹和某些细胞和组织化学免疫染色,简要操作,(1)制备抗体以相应抗原作为配体，与CNBr活化的Sepharose-4B偶联制成的亲和吸附剂，装柱后用于分离纯化抗体(2)制备金粒5nm金粒a用100二乙酯(diethylether)制备饱和磷(phosphorus)溶液(A)(Merck)，然后将棒状磷保存在水中并切成小段，迅速转移到10ml100二乙酯中，密封2h以上b离心收集固体部分，用1份溶液A与4份酯混合(溶液B)，同时制备1HAuCl4(氯金酸盐)，用0.22m滤膜过滤c在装有冷凝迥流管的长颈烧瓶中，加3mlHAuCl4溶液、240mlH2O，混匀后，加5.4mlK2C03溶液调pH到9.0d在搅拌下，加2ml溶液B到HAuCl4溶液中，于室温缓慢混合15mine加热迥流，除去二乙酯，冷却到4，制备的胶体金溶液可使用两星期,12nm金粒在快速搅拌下，加10ml0.07抗坏血酸溶液到一混合溶液(1mllHAuCl4，1.5m10.2molLK2CO3和25mlH2O中，然后补加蒸馏水到100ml，除抗坏血酸钠溶液外，其余溶液都要经0.22m滤膜过滤1720nm金粒制备4HAuCl4储备液(Merck)，经022m滤膜过滤后，取0.5ml4HAuCl4溶液加到200ml水(终浓度0.01)中，煮沸，然后加6ml1柠檬酸钠溶液，加热迥流0.5h，冷却到4，该胶体金溶液使用时间同上40nm金粒制备方法同上，仅仅是将1柠檬酸钠溶液用量由6ml改为3ml,(3)胶体金与抗体的连接抗体将抗体溶液(1mg/ml)对2mmolL硼酸缓冲液(pH9.0)透析，离心(100000g，1h，4，收集上清液立即与胶体金偶联(用不同稀释度抗体溶液与胶金偶联，以确定最佳浓度)胶体金胶体金溶液经离心3000g，15min(收集512nm粒子)；500g，15min(收集2040nm粒子)后，取5ml上清液pH(已用0.2molLK2CO3调节)与偶联抗体pI相近，用抗血清作偶联物时，其pH9.0与0.5ml抗体溶液迅速混合lmin，加100l10NaCl溶液，5min后，测定A280，以确定最佳抗体量偶联将0.5mL抗体溶液(约0.5mgml)与5ml胶体金溶液(pH已调)迅速混匀，2min后，加10BSA溶液(pH=9.0)，令其终浓度为10，静置1530min，离心60000g，1h(512nm粒子)；14000g，1h(20-40nm粒子)，获得抗体-胶体金偶联物洗涤在偶联物中加含1BSA的20mmolLTris缓冲液(pH8.2，经0.22gm滤膜过滤)，平衡洗涤1530min，重复离心，最终得到悬于1BSA溶液的抗体-胶体金悬液(加0.02molLNaN3)，测定A520。不同悬粒如40nm、20nm和5nm的悬浮液A值应分别控制在0.35、0.5和0.25。该法的标记率为7080,二、核素和非核素标记,许多蛋白质在合成过程或合成之后可通过修饰或标记生成磷酸化蛋白质，这种蛋白对某些功能起到敏感可逆的调节作用。在真核细胞中，细胞的增殖、分化、周期调控、信号传导和代谢过程都受制于蛋白激酶和磷酸酶活性的平衡。如用核素和非核素标记探针联合检测环化激酶(cycledependentkinases，CDK)磷酸化和脱磷酸化的反应，可以深刻地认识细胞周期的调控过程。近十年深入研究也为揭示肿瘤细胞的增殖机理和药物治疗提供了不少理论依据。胞外配体(如多肽生长因子)、胞内信号传递因子(如cAMP）以及钙离子的浓度与相应蛋白激酶的密切关系都是受蛋白质磷酸化作用调节控制的。这部分将重点介绍如何通过检测激酶或磷酸化酶来确定蛋白质磷酸化反应，如何用标记探针来鉴定蛋白质磷酸化,32P、33P、3H、14C和125I等物质都可用于标记蛋白质,1、核素标记,(1)32p正磷酸盐(orthophosphate),原理通过体内生物合成法来标记酶或蛋白质操作用HRP标记抗-磷酸酪氨酸抗体的试剂，并直接检测蛋白质的酪氨酸磷酸化材料表皮生长因子(EGF)刺激A431细胞株激活酪氨酸激酶，并使其受体上的酪氨酸发生磷酸化作用，用未刺激的A431细胞株作对照,操作,A.免疫沉淀细胞萃取溶液用抗-EGFR抗体进行免疫反应1h，然后将EGFR抗-EGFR抗体复合物在蛋白质G-琼脂糖凝胶进行免疫沉淀反应B.分离抗体复合物经SDS-PAGE(8)分离后，转移抗体复合物到PVDF膜上C.印记检测按蛋白质印迹法操作，用HRP-抗-磷酸酪氨酸抗体进行免疫反应后，再与发光底物ECL反应，接着置感光片上，曝光5min检测，结果表明在EGF刺激的细胞中EGF受体酪氨酸磷酸化的数量明显升高,(2)32P或32P-ATP,原理它们是通过体外生物合成使蛋白质磷酸化和脱磷酸化的,操作程序,(3)3H、14C或125I,原理它们可以标记到底物，通过检测由底物生成产物的量，即可换算出相应激酶的活性(体外检测),示意图底物+ATP产物+ADP,激酶,(4)其他核素35S蛋氨酸、35S半胱氨酸或者3H-亮氨酸等,2、非核素标记,许多蛋白质的丝氨酸和苏氨酸可以磷酸化，而不少与信号传递有关的蛋白质磷酸化又多发生在酪氨酸上。现在已有抗-磷酸丝氨酸、抗磷酸苏氨酸和抗-磷酸酪氨酸的抗体商品，其特异性较强，灵敏度较高。用这类抗体进行免疫印迹试验就能便捷地检测出它们的磷酸化程度。在SDS-PAGE中，由于磷酸化与未磷酸化蛋白质的等电点不同，所以致使它们二者的迁移率出现差异。将温育的与未温育的磷酸化蛋白质(酶)和磷酸酶反应液进行SDS-PAGE，从蛋白质(酶)迁移率的变化可以推论蛋白质(酶)磷酸化的程度。此法在采用效率很差32P-ATP或33P-ATP标记时，尤为适用，其操作详见应用实例,3、关于样品分析的若干问题,(1)SDS处理细胞(2)蛋白酶抑制剂(3)酶或蛋白质的免疫沉淀(4)磷酸酶消化(5)标记磷酸氨基酸的鉴定(6)体外酶活性测定,4、应用实例,肌肉分化期的MEF(myogeninEfa