大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化.ppt

大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化,实验目的实验原理实验试剂实验步骤注意事项,了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。,一、实验目的,二、实验原理,感受态细胞(Competentcells)受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competentcell)。,转化（transformation）是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。,转化的方法：化学方法(热击法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCl2法使用更广泛。,克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。,重组DNA转化细菌过程示意图,三、实验试剂,材料大肠杆菌E.coliDH5、pBS质粒、1.5ml离心管（又称eppendorf管）试剂LB培养基、0.1mol/LCaCl2、无菌水、氨苄青霉素（Amp）,四、实验步骤,大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)从E.coliDH5菌平板上挑取一单菌落，接种于LB液体培养基中，37振荡培养过夜。将该菌悬液以1:30100接种于LB液体培养基中，37250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培养;每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置10min后，于4，4000rmin离心2min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；,彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的0.1mo1LCaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10min；4000rmin离心10min；弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/LCaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。,质粒DNA的转化分别用2个100l感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面操作：第一组，质粒DNA组：10lpBS质粒DNA+100l感受态细胞悬液第二组，空白对照组，10l无菌水100l感受态细胞悬液,将以上各样品轻轻混匀，冰上放置30min，于42热激90s，然后迅速冰上冷却2min；立即向上述管中分别加入0.4mlLB液体培养基（在超净工作台操作，不需要在冰上），使总体积到0.5ml，摇匀后于37振荡培养约30min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Amp)；,在超净工作台取各样品培养液0.1ml在平板上涂布，分别接种于含Amp抗菌素的LB平板培养基上（做好标记，日期）,涂匀；在菌液完全被培养基吸收后，培养皿倒置于37培养箱中过夜(12-16小时)；观察转化子出现的情况，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养。,五、注意事项,防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。,感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速。为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。尽量在无菌状态下操作，减少污染的可能。,六、质粒DNA转化常见问题,对策,原因,1.感受态细胞低效2.抗生素使用错误3.转化后立即涂板忘记温浴,1.使用高效率的感受态细胞（106以上）2.复查质粒抗性，使用正确的抗生素3.转化后温浴30min左右，让抗性基因得以表达,七、问题与讨论,1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？2.如阴性对照中长出菌，原因？3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？,如果转化成功，由于质粒DN