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血管内皮生长因子对血管生成的作用09050841班杨志艳、高小帆、赵东东,题目,目录：,一、设计目的与意义,三、设计方案,二、血管内皮生长因子的作用及背景,四、实验设计,五、实验结果,六、心得体会,1、通过巩固、复习以前所学的基础医学知识，结合查阅的相关资料进行实验设计，使学生掌握生物医学实验设计的基本思路和基本方法，培养学生的创新能力和实践能力。2、通过本课程设计使学生对以后的专业课学习、实践与毕业设计等有所帮助。,一、设计目的与意义,1、血管内皮生长因子（VEGF），早期亦称作血管通透因子（VPF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。2、VEGF在内皮细胞中的作用血管渗透性:VEGF是一个通过刺激内皮细胞上同系受体介导多重功能的多效的生长因子。VEGF由于其对小静脉有高渗作用而被命名为VPF。事实上,VEGF是已知的最有效的VPF,比组织胺要强50000倍。由于VEGF及VEGFR途径在肿瘤血管生成中的中心作用,它已经是肿瘤学领域药物发展和基础研究的焦点。肿瘤血管的高渗透性被认为与肿瘤细胞表达VEGF有关。血管高渗透性可导致多种血浆蛋白,包括纤维蛋白原及其他凝固蛋白的外漏。这种能力可导致纤维蛋白在细胞外间质沉积,最终,二、血管生长因子的作用及背景：,可延缓水肿液体的清除,从而使正常组织抗血管生成向促血管生成转化。VEGF可增加多种血管床的渗透性,包括皮肤、腹膜、肠系膜和隔膜的血管床,可导致恶性腹水和恶性肿瘤性胸腔积液等病理状态。事实上,抑制VEGF可减少胸腔积液和腹水的形成。VEGF增加微血管渗透性的精确机制还不是很清楚。Dvorak等已经发现VEGF通过跨内皮细胞途径诱导大分子从内皮细胞渗出。其他研究者证实VEGF可通过其他跨细胞途径诱导内皮细胞开窗,或者是VEGF增加细胞间内皮细胞而打开相邻内皮细胞间的连接。最近更多的研究证明VEGF诱导渗透性可能是介导钙离子依赖通路,他涉及氧化亚氮生成、激活Akt通路和增加cGMP,这是除了激活前列腺素的Erk1/2途径外的一条新途径。,内皮细胞的激活:VEGF在血管内皮和内皮细胞中发挥着许多不同的作用。这些作用包括细胞形态学的改变,细胞骨架的变更以及刺激内皮细胞迁移和生长。VEGF可诱导增加许多不同的内皮细胞基因表达,包括促凝血组织因子和溶解纤维蛋白途径的蛋白,其中溶解纤维蛋白途径的蛋白包括尿激酶,组织型纤维蛋白溶酶原激活剂,纤维蛋白溶酶原激活剂的抑制剂,尿激酶抑制剂,金属基质蛋白酶,谷氨酸葡萄糖载体,氮氧合酶,整合素,和多种分裂素。VEGF已经被证实能通过释放氧化亚氮和前列腺素诱导活体外血管舒张。将VEGF注射入大鼠体内可造成短暂的心动过速,低血压和心脏输出量的减少。VEGF的这种作用可能可以从部分上解释临床抗VEGF实验时偶然发生高血压和头痛的现象。,3、VEGF与肿瘤VEGF可促进内皮细胞渗透、激活、存活、增殖、浸润和迁移,与肿瘤血管生成和淋巴管成密切相关,阻断VEGF信号途径可抑制肿瘤的生长和转移。肿瘤为自身的生存发展、创造有利的微环境,他可促进其微血管的生成,获取丰富的营养供应,而淋巴管的生成在肿瘤扩散过程中发挥着更重要的作用,因此阐明VEGF在肿瘤血管生成合淋巴管生成的机制,有利于为抗肿瘤治疗开辟一条有效的途径。新血管的形成是肿瘤生长转移和传播过程中的一种基本活动。因此,在癌症研究领域,人们对研究肿瘤血管生成的分子机制十分感兴趣。血管内皮生长因子(VEGF)路径是这一过程的关键调节者。VEGF/VEGFR轴由多重配基和受体质量,叠加交错组成,并且受体与配基结合具有专一性,在不同的细胞中具有不同的细胞类型表达和功能。启动VEGFR信号通路,触发了一个网状的信号过程,从而促进血管内皮细胞生长、转移和存活。此外,VEGF介导的血管渗透性,已经被证实与恶性渗出有关.最近,VEGF的一个重要作用表现为可动员内皮祖细胞从骨髓向远处转移从而形成新生血管。VEGF促进肿瘤血管生成的作用和与人类癌症的发病机制的关系是确定的,因而有必要设计和发展针对这一途径的抑制因子。许多的VEGF/VEGFR治疗的研究表明,这些因子能有效地抑制临床前模型的血管生成和肿瘤生长。因此,抑制VEGF途径被确认为是一种重要的有效的抗癌模式。,应用RNAi技术沉默血管内皮生长因子(VEGF)基因,探讨其对人结肠癌细胞系HCT116裸鼠移植瘤生长及其血管生成的影响。将自行构建的以VEGF基因为靶向表达短发夹状RNA的重组质粒(pAVU6+27-VEGF-siRNA)转染到结肠癌HCT116细胞株中(C组),以空质粒(pAVU6+27)转染为阴性对照(B组),经G418筛选出阳性克隆细胞,未转染质粒的HCT116细胞株为空白对照(A组),建立裸小鼠皮下移植瘤模型。通过测量移植瘤的质量、体积观察移植瘤生长;免疫组化检测瘤组织中VEGF蛋白表达及组织内的微血管密度(MVD)改变，得出VEGF在沉默情况下对肿瘤生长及血管生成的影响，从而得到VEGF对肿瘤生长及血管生成的影响。,三、设计方案,实验器材与用品：实验动物：BALB/c裸小鼠15只,45周龄,雄性,体质量1923g,购自中国科学院上海实验动物中心,SPF实验室饲养。实验试剂：人结肠癌HCT116细胞株，DMEM高糖培养基、标准小牛血清，含U6启动子的质粒pAVU6+27,表达VEGFshRNA质粒，兔抗人VEGF多克隆抗体,兔抗人因子相关抗原多克隆抗体,S-P9000免疫组化试剂盒,DAB显色试剂盒，G418,DOTAP脂质体转染试剂。,四、实验设计,1细胞培养及转染细胞培养于含10%灭活小牛血清,1105U/L青霉素,100mg/L链霉素的DMEM高糖培养液中,于37、5%CO2的培养箱中培养,取对数生长期细胞用于实验。采用Roche公司的DOTAP脂质体转染试剂盒包裹经灭菌处理的重组质粒(质粒脂质体=16)。转染前1d,换取新鲜培养液(含10%小牛血清的DMEM高糖培养液,37,5%CO2孵箱中培养)后调整浓度为2105/m,l以每孔2ml接种于6孔培养板中培养,待细胞增至60%80%时,将质粒-脂质体复合物转染至细胞中,18h后弃去转染液,换含新鲜培养液继续培养,弃去原培养液。,设计过程,重组质粒和空质粒脂质体转染HCT116细胞后,400g/mlG418筛选1周,实验组和阴性对照组均可见抗性克隆开始形成,空白对照组细胞全部死亡,换正常培养基继续扩大培养。两组转染细胞的阳性克隆继续细胞扩增、传代培养,取抗性克隆形成1周后细胞进行实验。转染重组质粒pAVU6+27-VEGFsiRNA的HCT116细胞记为C组,转染空质粒的pAVU6+27的HCT116细胞作为阴性对照B组,未转染质粒的HCT116细胞作为空白对照A组。,2裸小鼠移植瘤模型建立将已培养好基本长满瓶壁的3组HCT116结肠癌细胞PBS液冲洗2次,加入0.25%胰蛋白酶数滴消化,将消化好的细胞吸入离心管内,600r/min离心6min,弃上清,加入不含小牛血清的DMEM高糖培养基3m,l吸管吹打混匀(取适量计数细胞),再离心(600r/min,6min),弃上清,按每只裸小鼠皮下接种细胞数2.5107/m,l再加入无血清DMEM高糖培养基,供裸小鼠皮下接种用。准备好的HCT116细胞悬液经台盼蓝染色活细胞数95%,按每只0.2mlHCT116细胞悬液注射于消毒后的裸小鼠背部皮下。,3肿瘤生长的观察每隔5d测量肿瘤的长轴(a)和短轴(b),按公式V=ab2/2(cm3)求出近似体积代表肿瘤体积4。4病理学检查于第30天脱颈椎处死,剥离肿瘤,标本以4%多聚甲醛固定作组织病理检查。5免疫组化技术选取收集的术后病理标本石蜡块进行5m连续切片,防脱片处理后进行免疫组化染色。免疫组化S-P法步骤按试剂盒说明进行。,VEGF蛋白表达均以细胞质或细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性,按Breasalier半定量公式5判断染色结果,在每张切片上随机选取10个视野,根据细胞染色强度分为4级,并分别计分:阴性:细胞无着色(0分),弱阳性,浅黄色(1分),中度阳性:棕黄(2分),强阳性:棕褐(3分)。计数每一强度的视野数,根据下列公式计算每张切片的平均染色强度(intensityscore,IS):IS=(0F0+1F1+2F2+3F3),F为在10倍视野下计数。,6VEGF蛋白表达测算,7MVD结果判定因子阳性产物呈棕黄色细颗粒状,定位于血管内皮细胞细胞膜及细胞质。光镜下先以100倍视野选择3个微血管染色最丰富区(新生血管热点区),然后在200倍视野下计数每一区中的微血管,取其平均值。任何被因子染成棕色的内皮细胞或内皮细胞簇必须与邻近微血管、肿瘤细胞和周围结缔组织分界清楚,才可作为1个微血管计数,管腔大于8个红细胞及有较厚肌层的血管不计数,背景中阳性染色的浆细胞、白细胞依据形态排除.,8统计学处理数据均以-xs表示,采用SPSS10.0统计软件进行处理,两组间均数比较行t检验,多组间均数比较行单因素方差分析,双变量行Spearman相关性分析。,1裸鼠皮下移植瘤生长情况3组裸鼠皮下单侧接种野生型、转染PAVU6+27及pAVU6+27-VEGF的HCT116细胞后,观察肿瘤出现的时间、生长速度、肿瘤大小。VEGF靶向的siRNA干扰重组体pAVU6+27-VEGF转染HCT116细胞后与空质粒组、未转染组相比,致瘤性下降,肿瘤生长减缓(P005)。见表1。表1各组结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤比较(n=5,-xs)组别成瘤时间(d)30d肿瘤体积(cm3)30d肿瘤质量(g)未转染组7.331.53a0.2560.016a0.3240.026a空质粒组7.760.96a0.2480.014a0.3160.015a重组质粒组12.502.030.1690.0090.1920.022a:P005,与重组质粒组比较,五、实验结果,2各组移植瘤组织的病理检测结果2.1大体形态重组质粒pAVU6+27-VEGF转染组皮下肿瘤瘤体较小呈球形,黄白色,质软,剖面如鱼肉,剖面渗血较少;未转染质粒组及转染空质粒pAVU6+27组瘤体显著增大,表面结节状,剖面渗血较多。2.2光镜下形态未转染质粒组及转染空质粒pAVU6+27组肿瘤细胞结构完整,细胞大小不均,呈高度异形性,毛细血管较丰富,核/浆比例增大,提示肿瘤生长旺盛;重组质粒pAVU6+27-VEGF转染组肿瘤细胞结构模糊,毛细血管明显减少。,2.3免疫组化结果空载体转染HCT116细胞和HCT-116细胞荷瘤组织中VEGF均表达强阳性,表达位于肿瘤细胞的细胞质及细胞膜上,呈棕黄色。重组质粒转染HCT116细胞荷瘤组织中VEGF呈弱阳性表达,组间差异显著(P005)。重组质粒转染HCT116细胞荷瘤组织中MVD明显小于两对照组,组间差异显著(P005)。VEGF表达与MVD呈显著正相关(r=0.810,P001)。见表2。表2移植瘤组织中MVD和VEGF表达(n=5,-xs)组别MVDVEGF(IS)未转染组28.42.3a2.100.12a空质粒组27.42.4a2.040.14a重组质粒组14.41.61.060.10a:P005,与重组质粒组比较,C组肿瘤瘤块的体积(0.1690.009)cm3和质量(0.1920.022)g明显小于A、B组(P005)。A、B组荷瘤组织中VEGF均表达强阳性,表达位于肿瘤细胞的细胞质及细胞膜上,呈棕黄色。C组荷瘤组织中VEGF呈弱阳性表达,组间差异显著(P005)。C组荷瘤组织中MVD明显小于两对照组,组间差异显著(P005)。VEGF表达与MVD呈显著正相关(r=0810,P001)。结论应用RNAi技术沉默VEGF基因能明显抑制人结肠癌细胞系HCT116裸小鼠移植瘤的生长,其机制与其抑制移植瘤中VEGF的表达和瘤组织内血管生成有关。,肿瘤的恶性增殖受到多种因素的影响,其中肿瘤血管生长对实体瘤的生长起重要作用,是影响肿瘤生物行为的重要因素。VEGF是一种重要的促血管形成因子,通过增加微血管的通透性和特异性,与血管内皮细胞受体结合,促进血管内皮细胞的分裂和增殖,进而导致新生血管的生成,具有促血管形成和增加血管通透性的双重功能,而且还以自分泌的形式促进肿瘤细胞自身生长,在肿瘤的发展、转移及预后等方面均起着重要的作用。研究表明,在结肠癌中VEGF表达明显增