第三章--细胞生物学研究方法 2

第三章细胞生物学研究方法,第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞工程,甘肃农业大学细胞生物学第三章1,教学重点通过对本章的学习主要使学生掌握如下知识内容：细胞形态结构的观察方法；细胞组分的分析方法；细胞培养与细胞工程技术；分子生物学方法。向学生介绍细胞生物学的技术史和思想史，使之认识工具和方法与学科发展的相关性。使学生了解本学科基本的研究方法。,甘肃农业大学细胞生物学第三章2,细胞生物学研究方法形态学观察技术：各种光学显微镜和电子显微镜技术细胞化学技术：酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术、细胞结构成分的离心分离技术分析细胞学技术：流式细胞光度术、显微分光光度术和图像分析技术细胞培养和细胞融合技术分子生物学技术,甘肃农业大学细胞生物学第三章3,第一节细胞形态结构的观察方法,光学显微镜技术没有显微镜的创制，就没有今天的细胞超微结构的成就，没有超速离心机的设计，就不可能有分子生物学、分子遗传学和分子细胞学等这几门学科。,甘肃农业大学细胞生物学第三章4,显微镜与分辨率,1.明视距离：物体在人眼视网膜上成像的大小和物体与眼睛的距离有关。物体离眼睛的距离越近，视网膜上的物像就越大，眼睛的曲光度就随之增大，眼部肌肉就越发疲劳。经测试在物体离人眼25cm时，看物体又清楚，眼肌也不疲劳，因此把人眼正常工作距离定为25cm，称之为明视距离。,甘肃农业大学细胞生物学第三章5,甘肃农业大学细胞生物学第三章6,2、分辨力和光镜的分辨极限分辨力（Resolution）：又叫分辨本领，是指将邻近两点清晰区分辨认的能力。分辨极限（Limitofresolution）：对可见光来说，能清楚分辨出相邻两点之间的最小间隔为0.2m。(油镜)R0.61/n.sin（/2）0.610.5m/1.50.2m,甘肃农业大学细胞生物学第三章7,甘肃农业大学细胞生物学第三章8,普通复式光学显微镜光学显微镜的组成分为三部分：光学放大系统：为两组玻璃透镜：目镜和物镜；照明系统：光源、折光镜和聚光镜；机械和支架系统：保护光学系统的准确配制和灵活调控,甘肃农业大学细胞生物学第三章9,放大倍数：目镜的放大倍数物镜的放大倍数,普通光学显微镜,普通光镜的最大分辨率为0.2m，是可见光最短波长的一半；光学显微镜的分辨率由光源的波长和物镜的镜口角决定。,甘肃农业大学细胞生物学第三章10,荧光显微镜技术以紫外线为光源，用以照射被检物体使之发出荧光，然后在显微镜下观察其形状及所在位置的一种镜检术。能够对细胞进行定性、定位、定量观察荧光：细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照射后能发出可见光线，称为荧光。荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。,甘肃农业大学细胞生物学第三章11,甘肃农业大学细胞生物学第三章12,荧光显微镜,荧光显微镜的基本构造,甘肃农业大学细胞生物学第三章13,能够解决的问题：可以对特异蛋白质等生物大分子进行定性定位；有关细胞与组织中物质的吸收与运输，化学物质的分布与定位等。例如用吖啶橙对细胞DNA、RNA染色，显示不同颜色荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙色荧光。,甘肃农业大学细胞生物学第三章14,相差显微技术光波通过两种不同折射率的物质时，其波长、振幅和相位均有不同程度变化，这种变化在相差显微镜中利用衍射和干涉现象形成明暗之差，从而进行肉眼观察。适用于观察较透明的或染色反差小的细胞组织。,甘肃农业大学细胞生物学第三章15,相差显微镜比普通光镜多了2个部件：1）在聚光器上增加一个环形光阑；2）在物镜后焦面增加一个相板，相板上有一个环形区，通过环形区的光比从其它区域透过的光超前或滞后14，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。,甘肃农业大学细胞生物学第三章16,光波的干涉,甘肃农业大学细胞生物学第三章17,如相板的环形区使直射光超前14，加上开始直射光超前的14，直射光共超前12，直射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。如相板的环形区使直射光滞后14，加上开始直射光超前的14，两者相抵直射光不发生变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增加，产生明反差。结果未经染色的活细胞内的各种组织就可显现不同的明暗对比。相差显微镜可观察活细胞的各种活动，如细胞迁移、分裂，运动等。,甘肃农业大学细胞生物学第三章18,微分干涉显微技术（DIC）通过光束照射，经显微镜不同部位，样品出现厚度上的微小区别，从而形成明暗差异，增强样品立体感，适用于观察活细胞中较大的颗粒和细胞器。,DIC显微镜下的硅藻,甘肃农业大学细胞生物学第三章19,共焦激光扫描显微镜技术（CLSM）,甘肃农业大学细胞生物学第三章20,共焦激光扫描显微镜技术是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。共焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。,甘肃农业大学细胞生物学第三章21,甘肃农业大学细胞生物学第三章22,甘肃农业大学细胞生物学第三章23,免疫荧光技术（A）和激光扫描共焦显微镜（B）比较：显示果蝇原肠胚表层细胞质内免疫荧光标记的微丝分布,电子显微镜技术虽然光学显微镜在研究细胞结构中起着极其重要的作用，但是其分辨率只能达到一定限度，所以要研究细胞内部的精细结构，就必须借助于分辨率更高的电子显微镜。,甘肃农业大学细胞生物学第三章24,使用了电子束作为光源，其分辨率为0.2nm，但其实际分辨率常受到生物制样本身的限制。基本构造：电子束照明系统：包括电子枪、聚光镜成像系统：包括物镜、中间镜及投影镜等真空系统记录系统,甘肃农业大学细胞生物学第三章25,与光学显微镜的主要区别：分辨率不同：普通光镜的最大分辨率为0.2m，电镜分辨率为0.2nm光源不同：光学显微镜为可见光或紫外光，电镜为电子束透镜不同：光镜为玻璃，电镜为电磁透镜电镜要求为真空电镜有记录系统,甘肃农业大学细胞生物学第三章26,JEM-1011透射电子显微镜,甘肃农业大学细胞生物学第三章27,电镜制样技术介绍对电镜观察的样品的要求：要求样品很薄，保证电子束的穿过要求更好的保持样品的精细结构一般样品制备经过：固定、脱水、包埋、切片、染色等,甘肃农业大学细胞生物学第三章28,分类：透射电镜（TransmissionelectronMicroscopeTEM）扫描电镜（ScanningelectronMicroscopeSEM）,甘肃农业大学细胞生物学第三章32,扫描电子显微镜（SEM）,甘肃农业大学细胞生物学第三章33,注射针头的扫描电镜照片,不同倍率的果蝇扫描电镜照片,甘肃农业大学细胞生物学第三章34,可以用计算机将黑白照片处理成彩色,肺细支气管粘膜杯状细胞和纤毛细胞扫描电镜照片,红血球,培养细胞,扫描电镜的特点：,高的分辨率；很强的立体感；放大倍率范围广；应用范围广，样品适用率大,甘肃农业大学细胞生物学第三章35,扫描电镜生物样品的制备,SEM生物样品制备的基本要求生物样品与金属、矿物等材料不同，它具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低以及含水量多（有的含水量达80%以上）等特点。因此，在处于高真空状态下的扫描电镜内观察生物样品时，必须严格地遵循一定的原则和操作程序，对样品进行必要的预处理。,甘肃农业大学细胞生物学第三章36,生物样品制备的基本操作程序,甘肃农业大学细胞生物学第三章37,主要用来观察样品表面的形貌特征取材清洗固定：戊二醇等脱水：系列酒精脱水干燥：CO2临界点干燥器离子喷射镀金：将从干燥器中取出的材料至于铜制圆形标本托上，后将标本托置于真空喷镀仪内，先喷一层10nm厚的碳膜，后喷镀一层10-20nm的金或铂的薄膜；观察。,甘肃农业大学细胞生物学第三章38,甘肃农业大学细胞生物学第三章39,透射电镜（TEM）,甘肃农业大学细胞生物学第三章40,甘肃农业大学细胞生物学第三章31,透射电镜标本制备过程:取材:尽可能保持生活状态,避免损伤，必须耐真空，由于电子穿透力弱,标本必须超薄，标本反差应尽可能大(生物材料原子系数低,图像反差差,不易出现明暗差别),甘肃农业大学细胞生物学第三章41,固定:为防止生物样品在死亡后和脱水过程中产生结构改变,离体生物标本迅速固定。常用戊二醛和四氧化锇固定，戊二醛在蛋白质分子之间形成共价键,将它们交联在起。四氧化锇除与蛋白共价结合外,还对脂类有良好的固定效果。,甘肃农业大学细胞生物学第三章42,脱水:标本必须置于高真空中进行电镜观察,但电镜不能观察含水的生物标本，因此需脱水处理。另外由于包埋剂与水不溶，用脱水剂可将组织中游离水脱去，有利包埋。包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、电子轰击,则在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。,甘肃农业大学细胞生物学第三章43,切片:电子穿透力很弱,需将样品制成50100nm厚的薄片。染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成,它们散射电子能力弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,为加大生物样品反差,进行染色。常用的染色剂：醋酸铀、枸橼酸铅。,甘肃农业大学细胞生物学第三章44,负染法(negativestaining):将病毒、纤维、核糖体或分离的生物大分子样品放于覆有亲水性支持膜的载网上,滴加磷钨酸,样品干燥后重金属盐沉积于样品周围使样品和背景形成显著的明暗对比,这种染背景而不染样品的方法叫负染。,甘肃农业大学细胞生物学第三章45,冷冻蚀刻复型电镜技术(freezeetchingrep1icae1ectronmicroscopy)将标本用液态超低温冷冻,真空中割断,升温使冰升华,细胞内外凡含水多的地方因失水而下陷,膜和其它一些结构显露出来,增强了断面的浮雕效果蚀刻。标本蚀刻后以45喷金,90喷碳后将组织溶解掉,剩下的碳-金属膜就是复型。将复型膜置于透射电镜下观察,可观察蚀刻面所暴露的各种微细结构。,甘肃农业大学细胞生物学第三章46,冷冻：制冷剂（一般为液态氮）快速冷冻，使样品固定。断裂：在低温真空中将样品劈开，断裂面上可见各种细胞内结构。蚀刻：升温使冰升华，细胞内外含水多的地方因失水而下陷，膜和其它结构显露出来，增强了断面的浮雕效果。,甘肃农业大学细胞生物学第三章47,复型：以45喷铂金，90喷碳固定，显示立体结构剥膜：将样品取出，浸泡于腐蚀夜中将生物组织腐蚀掉，只剩下铂碳复型膜，捞于载网上干燥后透射电镜观察,甘肃农业大学细胞生物学第三章48,肌动蛋白纤维,一、超速离心技术分离细胞（组分）及生物大分子,甘肃农业大学细胞生物学第三章49,原理：利用颗粒大小的不同:差速离心法密度梯度离心利用颗粒密度的不同:等密度离心法,甘肃农业大学细胞生物学第三章50,密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。用于分离组分大小差别不显著的组分,甘肃农业大学细胞生物学第三章51,甘肃农业大学细胞生物学第三章52,差速离心（differentcentrifugation）：用于分离大小、形状不同显著的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离，将各种亚细胞组分和颗粒分次沉淀的分离技术。,甘肃农业大学细胞生物学第三章53,甘肃农业大学细胞生物学第三章54,在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核糖体、病毒等。,甘肃农业大学细胞生物学第三章55,等密度离心法：按细胞组分的浮力密度不同进行分离的方法。适用于大小、形态相似而密度不同的组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化铯的密度梯度沉降在达到与自身密度相等的位置就停滞不再向下沉降。,甘肃农业大学细胞生物学第三章56,二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法原理：为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂质等细胞组分，通常利用一些显色剂与所检物质中的一些特殊集团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。,甘肃农业大学细胞生物学第三章57,福尔根（Feulgen）反应可以特异显示DNA的分布：酸水解可以去除RNA，仅保留DNA，并除去DNA上嘌呤脱氧核糖核苷酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露的醛基与希夫试剂反应呈紫红色。PAS反应（过碘酸雪夫反应）则可确定多糖的存在四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用以证明脂肪滴的存在苏丹（深红色）通过扩散进入脂滴中，使脂肪滴着色,甘肃农业大学细胞生物学第三章58,在米伦（Millon）反应中，氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应，形成红色沉淀Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）茚三酮反应：显示蛋白质,甘肃农业大学细胞生物学第三章59,Schiff反应,甘肃农业大学细胞生物学第三章60,三、特异蛋白抗原的定性与定位免疫荧光和免疫电镜技术是最常见的研究细胞内蛋白质分子定位的重要技术。,甘肃农业大学细胞生物学第三章61,免疫荧光技术概念：将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。例如：将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注射入培养细胞中，可以看到肌动蛋白分子装配成肌动蛋白纤维。包括：荧光抗体的制备、标本的处理、免疫染色及观察记录等过程。,甘肃农业大学细胞生物学第三章62,免疫电镜技术概念：用抗原抗体反应的原理，有效提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。应用：蛋白分泌的研究，通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；一些结构蛋白的研究，包括膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。,甘肃农业大学细胞生物学第三章63,原位杂交技术：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。应用：在显微与亚显微水平上的基因定位、特异mRNA表达等问题,甘肃农业大学细胞生物学第三章64,四、细胞内特异核酸序列的定位与定性,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,甘肃农业大学细胞生物学第三章65,五、利用放射性标记技术研究生物大分子在细胞内的合成动态放射自显影技术：利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。对细胞内生物大分子进行动态研究和追踪是这一技术的特征。,甘肃农业大学细胞生物学第三章66,甘肃农业大学细胞生物学第三章67,包括两个主要步骤：同位素标记的生物大分子的渗入和细胞内同位素所在位置的显示。同位素标记的前体物渗入细胞即标记，标记后用自显影方法追踪被标记物在细胞中的位置与代谢速率。,甘肃农业大学细胞生物学第三章68,定量细胞化学分析技术前面介绍的都是对细胞内不同成分的细胞化学定性与定位方法，下面介绍两种细胞化学的定量分析方法。显微分光光度测定技术：是利用细胞内某些物质对特异光谱吸收的原理，用来测定这些物质如核酸与蛋白质等在每一个细胞内含量的一种实验技术。如DNA对紫外线最高吸收波长是260nm。细胞显微分光光度法分为：紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法,甘肃农业大学细胞生物学第三章69,流式细胞仪可定量的测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体分离出来。,甘肃农业大学细胞生物学第三章70,特点：测量速度快，几万个细胞/秒可进行多参数测量，具有明显的统计学意义综合了多学科的科技成果即是细胞分析技术，又是精确的细胞分选技术,甘肃农业大学细胞生物学第三章71,用流式细胞计分选细胞,甘肃农业大学细胞生物学第三章72,细胞培养概念细胞培养（cellculture）：是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。优点：离体条件下观察细胞生命活动规律，不受体内环境影响，可人为改变条件，进一步观察生理功能的改变。,甘肃农业大学细胞生物学第三章73,细胞培养：有充分营养物质的培养基和适宜的环境条件，培养基多种氨基酸、维生素，Ca2+、Mg2+、PH等，温度、光照等。动物细胞培养：原代培养（primaryculture）：直接取材于有机体组织的细胞进行培养传代培养（secondaryculture）：把原代培养的细胞从培养瓶中取出进行培养,甘肃农业大学细胞生物学第三章74,甘肃农业大学细胞生物学第三章75,植物细胞培养：为植物育种开辟一条崭新的途径单倍体细胞培养如果用花药在人工培养基