2细胞生物学研究方法课件

第二章细胞生物学的研究方法,Chapter2Howcellsarestudied,第四类研究方法,第三类研究方法,第二类研究方法,Cell,生化化学分析技术,其它实验技术,细胞生理学技术,第一类研究方法,形态观察技术,第一节形态观察技术,普通光镜,特殊光镜,形态观察,扫描式电子显微镜,扫描隧道电子显微镜,透射式电子显微镜,冰冻蚀刻技术,紫外光显微镜,暗视野显微镜,相差显微镜,微分干涉差显微镜,荧光显微镜,激光共聚焦显微镜,光学显微镜,电子显微镜,1.普通光镜的结构:,（一）普通光学显微镜,一、光学显微镜,第一节形态观察技术,2.普通光镜的成像原理,光学显微镜的光路图,第一节形态观察技术,切片机(microtome):,第一节形态观察技术,在普通光学显微镜下，细胞结构呈半透明状，不易看清。,往往将标本切片进行染色提高可辨程度。,第一节形态观察技术,未染色,已染色,取材固定脱水包埋切片脱蜡复水染色脱水透明封片观察,1.紫外光显微镜,紫外线显微镜以紫外线(波长介于400nm与X射线之间)为光源，分辨率可提高1倍，可以看到许多在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。此外，核酸和有些蛋白质可吸收一定波长的紫外线，因而这种显微镜可用来测定细胞核中的核酸含量。,（二）特殊光学显微镜,第一节形态观察技术,然而，波长越短的紫外线越不易穿透普通玻璃，故必须用以特殊材料（如石英、萤石(CaF2)、碳酸锂等）制造的光学玻璃来制作显微镜透镜，造价较高。,另外，紫外线显微镜还要求配置有照相装置，价格比较昂贵。,第一节形态观察技术,实用性较差,2.暗视野显微镜,这种显微镜使照明光线不能直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。,第一节形态观察技术,中央遮光板,第一节形态观察技术,视野的背景黑物体的边缘亮,利用这种显微镜能见到小至5nm的质点，分辨率比普通显微镜高了40倍，有一些细胞器，如核、线粒体，均清晰可见。,3.相差显微镜,荷兰物理学家F.Zernike(1932)：提高了活细胞结构的反差，从而解决了对活细胞观察的难题。,获诺贝尔物理奖(1953),第一节形态观察技术,(phasecontrastmicroscope),特点：在聚光器或光源上加了一环形光阑(annulardiaphragm),在物镜中加了一环形相板(annularphaseplate)。,相差显微镜的构造:,上有一环形区，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物质）：环形区的设计深度（或高度）恰好可使通过此区的光线提前或延后1/4光程差。,使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。,第一节形态观察技术,相差显微镜的光路图解,第一节形态观察技术,根据设计，只有未透过标本的直射光可通过相板环形区，而透过标本的偏折光则由相板其他部分通过。两组光线和轴后发生干涉现象。,两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（正反差）结构比周围介质更加变暗。,未透过标本的直射光（通过相板环形区）与透过标本的偏折光（由相板其他部分通过）和轴后发生干涉：,第一节形态观察技术,S-D,S,D,如果为凹形相板：,通过样品的光线延后1/4,-1/4,-1/4,则两组光波相加，振幅加大，形成亮反差（负反差）标本结构比周围介质更加变亮。,第一节形态观察技术,S+D,S,D,如果为凸性相板：,由于标本的各种结构的厚度和折射系数不同，在相差显微镜下显示出不同的明暗度。,-1/4,+1/4,4.微分干涉差显微镜,Nomarski(1952)在相差显微镜原理的基础上发明的：又称Nomarski相差显微镜，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。,第一节形态观察技术,(differentialinterferencecontrast(DIC)microscope),与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大。,DIC显微镜首先DIC利用的是偏振光。此外，除了物镜外，还增加了四个光学组件：偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。,DIC显微镜使细胞的细微结构立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。,第一节形态观察技术,荧光显微镜的成象原理,5.荧光显微镜,第一节形态观察技术,特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式,分裂细胞的免疫荧光图像,不同荧光染料,标记,抗体,抗原(细胞的蛋白质成分),特异性结合,特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式,6.激光共聚焦显微镜,第一节形态观察技术,(LaserConfocalMicroscope,LCM),光源：,通过共聚焦可进行光学切片对固相、液相物体均可进行观察,特点：,激光,Q550MW型LCM,4.冰冻蚀刻技术,2.扫描式电子显微镜,3.扫描隧道电子显微镜,1.透射式电子显微镜,二、电子显微镜,第一节形态观察技术,电镜问世的必然性,分辨力的概念及其提高方法,分辨力(resolution)是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力，通常是用相邻两点间的距离来表示，可通过公式换算出：,可见光波长为400700nm，显微镜分辨率的最小数值不会小于0.2m，这一数值是光学显微镜分辨率的极限。,镜口率的大小决定于镜口角的大小和物镜与标本间介质折射率的大小,第一节形态观察技术,电镜问世的必然性,限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长，一般光学显微镜的最大放大倍数为10001500。,小于0.2m的一些细微结构，称为亚显微结构(submicroscopicstructure)或超微结构(ultrastructure)，在光学显微镜下无法看清。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。,0.2m,第一节形态观察技术,表各种光及电子束的波长,Ruska(19331938)便选择了电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限，发明了透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)。,电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。,第一节形态观察技术,电子显微镜与光镜的成像原理比较：,第一节形态观察技术,电子显微镜与光镜的主要区别,第一节形态观察技术,由于电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05m的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍。,1.透射电子显微镜,第一节形态观察技术,Figure3-20.Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.,内质网透射电镜图（伪彩色）,透射式电子显微镜(TEM),第一节形态观察技术,它是将标本表面上发射出的次级电子，被带样电荷的栅极收集后，即向电子显象管发送信号，在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本表面的真实结构。,2.扫描电子显微镜,用来观察标本的表面形态结构。,第一节形态观察技术,(scanningelectronmicroscope,SEM),扫描式电子显微镜,第一节形态观察技术,耳听毛的扫描电镜图像,第一节形态观察技术,3.扫描隧道显微镜,其关键部件是有一个加上一定电压的精密探针，当探针接近物质时，由于隧道效应而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。,Binnig、Rohrer等(1981)发明：,荣获1986年诺贝尔奖！,据量子力学中隧道效应设计，用来显示晶体表面原子布阵,第一节形态观察技术,(scanningtunnelingmicroscope,STM),当探针沿物质表面扫描时，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图象化，即可显示出原子水平的凹凸形形态。,第一节形态观察技术,扫描隧道显微镜的分辨率很高（横向为0.1-0.2nm,纵向可达0.001nm）。,扫描隧道显微镜能直接观察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白质等)的原子布阵，也能观察一些生物结构(如生物膜、细胞壁等)的原子排列。在生物学研究中发挥着重要作用，将把生物学研究推进到纳米科学水平。,其优越之处：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。,第一节形态观察技术,扫描隧道电子显微镜下金原子的晶格排列图像,第一节形态观察技术,亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。,4.冰冻蚀刻技术,冰冻断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。,第一节形态观察技术,(freeze-etching),将标本于-100干冰中或-196液氮中，超低温冰冻。然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构蚀刻(etching)。,(2)冰冻蚀刻技术的操作步骤:,第一节形态观察技术,蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为复膜(replica)。,复膜,复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,第一节形态观察技术,(3)细胞冰冻断裂后的电镜图像,第一节形态观察技术,第一节形态观察技术小结,光学显微镜,电子显微镜,形态观察,第二节生物化学分析技术,二、免疫细胞化学,三、显微光谱分析技术,四、放射自显影术,五、超离心技术,六、分子杂交技术,七、PCR技术,一、组织化学与细胞化学技术,八、层析技术,FACS技术,一、组织化学和细胞化学技术,组织化学和细胞化学染色方法(histochemicalandcytochemicalstainingmethod)依据化学反应原理，对无色透明细胞的某些成分进行定性和定位研究。细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成份发生反应而着色的原理，从而得以对某种成份进行研究和分析。,利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。,第二节生物化学分析技术,最典型的组织化学显示法是Feulgen反应显示法(Feulgenreaction)。此法由Feulgen和Rossenbeck(1924)发明，对DNA的反应具有高度专一性。,其原理是:标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红与醛基反应，形成含有醌基的化合物，醌基为发色团，呈现出紫红色。,第二节生物化学分析技术,免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原结合，对抗原进行专一定位测定的技术。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。,二、免疫细胞化学(immunocytochemistry),第二节生物化学分析技术,常用的标记物有荧光素和酶：,标记荧光素的称为免疫荧光法(immunofluorescenttechnique)，常用的萤光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。标记酶的称为酶标免疫法(enzyme-labelledantibodymethod)，常用的酶有辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)等，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物或有色物，从而显示出抗原的存在部位。,第二节生物化学分析技术,抗体与抗原的结合方法可分为以下两种：,第二节生物化学分析技术,直接法,间接法,将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位,间接免疫细胞化学法的原理示意图,第二节生物化学分析技术,第一抗体（一抗）,第二抗体（二抗）,用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态,第二节生物化学分析技术,Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay（ELISA),此颜色深浅可用酶标仪精确地测定出来,如酶联免疫吸附试验,酶与底物反应产生有色产物，颜色深浅代表了反应的强弱,卤虫孵化腺细胞的ELISA染色照片(樊廷俊等,2003),三、显微光谱分析技术,细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸(260nm)、蛋白质(280nm)、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。,第二节生物化学分析技术,细胞分光光度计：,第二节生物化学分析技术,UV为光源石英透镜配有分光光度计,根据细胞成分所具有的这种特性，可利用细胞分光光度计(cytospectrophotometer)对一定的成分进行定位、定性，甚至定量测定。,放射性同位素发射出的各种射线能使照相乳胶中的溴化银晶体还原(感光)。利用放射性物质使照相乳胶膜产生该物质自身影像的技术，称为放射自显影术。放射自显影的切片用染料染色后，便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或定量测定。,四、放射自显影术,第二节生物化学分析技术,(autoradiography),由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用14C和3H标记(14C和3H均为弱放射性同位素，半衰期长:14C为5730年;3H为12.26年)。,一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷来显示DNA，用3H-尿嘧啶核苷显示RNA。在研究蛋白质和粘多糖时，则分别选用3H-氨基酸和3H-甘露糖、3H-岩藻糖等。,第二节生物化学分析技术,常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷显示DNA的放射自显影图像,第二节生物化学分析技术,放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行电镜自显影（electron-microscopicautoradiography）。,电镜自显影照片,要研究细胞的各中结构和成分的化学性质和生理功能，需要把它们分离和抽提出来进行研究。离心是研究亚细胞成分和生物大分子的必要手段。细胞匀浆后，悬液中含有各种细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体等）及各种大分子。要想把它们一一分离开，只利用普通低速离心机是很难做到的。,五、超离心技术,第二节生物化学分析技术,离心机结构与原理示意图,第二节生物化学分析技术,离心机结构与原理示意图,第二节生物化学分析技术,被离心的物质所受的离心力不仅与转速有关，而且还同物质到转头中心的距离有关。因此要准确表示离心条件要用离心力，而不单是转速。离心力(g)是由角速度和旋转半径(R)的大小决定的，单位为克，计算公式如下:,g=2R,第二节生物化学分析技术,各种颗粒在离心场中的沉降速度不同，这取决颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬液介质的密度和粘度有关。,式中S为沉降系数(秒)；R为沉降颗粒到转头中心的距离(半径，cm)；为角速度，以每秒转动的弧度表示；t为时间(秒)。,当颗粒受到的净离心力（离心力与浮力之差）与溶剂的摩擦阻力达到平衡时，单位离离心场强度的沉降速度为定值，此即为沉降系数(sedimentationcoefficient,S)。,第二节生物化学分析技术,根据分离的对象和目的不同，超离心技术可分为两大类：,用于制备和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品,分析和测定制剂中大分子的种类和性质(浮力密度和分子量等),第二节生物化学分析技术,利用肝脏制备各种亚细胞组分的制备离心过程示意图,第二节生物化学分析技术,差速离心,密度梯度离心,CsCl密度梯度离心,蔗糖密度梯度离心,第二节生物化学分析技术,流式细胞分选术(fluorescence-associatedcellsorting,FACS),第二节生物化学分析技术,用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。,六、分子杂交技术,原理：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。,第二节生物化学分析技术,(molecularhybridization),核酸杂交原理示意图,第二节生物化学分析技术,在高pH值下，染色体DNA解链，带标记的核酸探针即可与染色体一定部位的互补单链DNA杂交。,这种方法既可检测DNA序列，也可检测RNA序列。既可用放射性探针法，又可使用免疫探针法。,在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术，称为原位杂交(insituhybridization)。,第二节生物化学分析技术,荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH):,FISH技术的原理图解,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,DNAchip技术,第二节生物化学分析技术,七、PCR技术,根据双链DNA的变性与复性和分子杂交原理设计出的技术，目的是将极微量DNA大量扩增。原理：将DNA片段经过若干次解链和复性循环，大量扩增，甚至可扩增到十几亿倍，以便于对已知DNA片段进行分析，如基因分析、序列分析、进化关系分析和临床诊断等。,第二节生物化学分析技术,(多聚酶链反应,polymerasechainreaction),PCR反应原理,第二节生物化学分析技术,经过PCR获得的大量DNA片断都是以原有的微量DNA片断为模板扩增而来，故此技术亦称为分子克隆技术(molecularcloning)。,八、层析技术,用于细胞组分的分离及其纯化,第二节生物化学分析技术,凝胶过滤柱层析,第二节生物化学分析技术,离子交换柱层析,亲合层析,第二节生物化学分析技术,第三节细胞生理学技术,一、膜电位检测技术,二、膜片钳位记录技术,三、细胞电泳,一、膜电位检测技术,细胞的质膜内外两侧由于阳离子浓度不同而形成浓度梯度差（常为外高内低）,从而在质膜两侧造成一定的电位差，该电位差即称为膜电位(membranepotential)。膜电位的大小因细胞种类不同而异，范围在-20-100mV之间，负值表示膜内与膜外相比为负。,第三节细胞生理学技术,因而膜电位的变化反映了细胞的生理变化，测定膜电位的数值可作为细胞生理状态的一个指标。在神经传导和肌肉收缩运动中膜电位的变化起着极其重要的作用。,第三节细胞生理学技术,细胞体积微小，要使用极其微细的电极进行测量膜电位，这种电极称为微电极。,微电极,微电极是由用玻璃毛细管拉制成的细管和插入一条金属丝组合而成。,用于插入细胞中的微电极的直径不超过1m。微电极通过导线和示波器或大电位计相连。,第三节细胞生理学技术,(microelectrode),测量时使用一对微电极，一个插入细胞内，另一个置于细胞外的介质中，这样即可显示或记录膜电位的变化。,神经细胞的静息电位和动作电位,第三节细胞生理学技术,微电极技术也可用于测量细胞内局部的某种离子浓度，进行着种测量时两个位电极都要插入细胞内。,第三节细胞生理学技术,离子是通过膜上的离子通道（亲水小孔）进出细胞的。为了检测单个特定离子通道的性质和部位，德国马普研究院的E.Neher和B.Sakmann经过长期合作研究，终于在1976年研制成功了可检测极低浓度的无机离子通过膜通道的膜片钳位记录技术。,二、膜片钳位记录技术,该技术的主要技术关键：可记录通过细胞微小质膜片段的微弱电流(1.01.210-11A)。,第三节细胞生理学技术,(patch-clamprecording),检测时，用内经约为1m的玻璃管电极将细胞质膜紧紧吸住，或拉下来，以测定进入管内的离子的种类和数量，从而表明离子通道的性质和功能。单个离子通道的直径约为0.50.6nm，膜电位的变化可引起离子通道的开启或关闭，膜片钳位技术能检测出这种变化。,第三节细胞生理学技术,膜片钳位记录技术中几种常用的实验方法,第三节细胞生理学技术,胆囊炎Cl-通道；癫痫Na+和K+通道；心血管病Ca2+通道；神经失常Ca2+通道。,E.Neher和B.Sakmann荣获1991年诺贝尔奖,第三节细胞生理学技术,有些疾病与离子通道失常有关，例如,膜片制导技术对许多因离子通道失常而引起的疾病的诊断和治疗有着重要的应用价值。现在已根据该技术的理论和技术研制出了许多有效的药物。,三、细胞电泳,细胞表面带有许多荷电基团，有的为正电荷，有的为负电荷，正负相抵总静电荷为负值，因而细胞在悬液中总是向电场的正极移动，细胞在外加电场的作用下发生泳动的现象称为细胞电泳(celleletrophoresis)。,第三节细胞生理学技术,各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的电位。细胞电泳装置即是根据这种原理设计出来的。,电位在诊断疾病上有一定价值。此外由于细胞在电场中的泳动速度不同，细胞电泳尚可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分开。,第三节细胞生理学技术,山东大学刘玉章先生设计的SD型细胞电泳仪,第三节细胞生理学技术,主要介绍几种对细胞进行整体或局部进行手术处理的技术，这些技术在细胞工程领域中有很重要的应用价值。,一、细胞培养技术,二、显微操作术,三、细胞融合技术,四、染色体分析技术,第四节其它实验性操作技术,一、细胞培养,活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，否则就要死亡。因此，要进行体外细胞培养，就要尽可能满足细胞在正常体内生理状态下的各种条件，其中选择最佳培养基是最关键的因素。,细胞培养技术(cellculture)或称组织培养技术即是选用各种最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。,第四节其它实验性操作技术,1.动物细胞培养,组织培养工作开始于20世纪初，Harrison(1907)最早对两栖类胚胎的神经管组织进行了悬滴培养。真正开创大规模细胞培养工作是在20世纪40年代，W.Earle和R.Dulbecco设计出了细胞培养液配方，并开始了单细胞的悬液培养，细胞培养工作才得到广泛发展。,培养的动物细胞,倒置显微镜,第四节其它实验性操作技术,群体培养：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；克隆培养：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，此种集落即称为克隆(clone)。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。此外，为了制取细胞产品而设计了规模培养法，如转鼓培养法、发酵罐培养。,细胞培养方式大致可分为两种：,第四节其它实验性操作技术,原代培养（primaryculture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要从更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。,细胞株（cellstrain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。,针对不同种类的细胞，学者们设计出了许多细胞培养基配方，目前使用比较广泛的化学合成培养基(chemicallydefinedmedium)有TC-199、MEM、L-15和RPMI-1640等。但是在工作中要针对不同的培养对象来选择最适培养基，培养基选择恰当与否是细胞培养是否成功的关键。,第四节其它实验性操作技术,细胞所需要的营养成分要尽量予以满足；要保持适当的渗透压；严格控制pH；添加细胞所需的生长因子。,为了满足细胞生长所需的一些营养条件，常在培养液中加入适量的血清。然而血清的来源有限，而且血清的成份复杂，影响实验结果的分析，因而近来研究出无血清培养技术。,第四节其它实验性操作技术,在细胞培养工作中，有几种因素需要特别关注：,正常组织的初级培养物，细胞传代培养均有一定的限度，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化(transformation)即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。如HeLa细胞系（1951年从HenriettaLacks的宫颈癌细胞培养而成）。迄今我国业已建立了上百个细胞系，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。,通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株或细胞系。,第四节其它实验性操作技术,正常组织的初级培养物，细胞传代培养均有一定的限度，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化(transformation)即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。如HeLa细胞系（1951年从HenriettaLacks的宫颈癌细胞培养而成）。迄今我国业已建立了上百个细胞系，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。,通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株或细胞系。,第四节其它实验性操作技术,表三、实验室中常用的几种细胞系,HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin1951,植物细胞培养最明显的特点是：可进行组织培养，由外植体生长出植株；不易无限传代和建立细胞株。,2.植物细胞培养,第四节其它实验性操作技术,(1)外植体培养，诱发产生愈伤组织：如果条件适宜，尚可培养出再生植株。,(2)悬浮细胞培养：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。,植物细胞培养大体有如下几种技术:,(3)原生质体培养：细胞杂交，转基因等,(4)单倍体培养：通过花药或花粉培养获得单倍体植株。,第四节其它实验性操作技术,二、显微操作术,为了直接对微小细胞进行手术操作和解剖，又设计发明了显微操作技术。所谓显微操作术(micromanipulation)就是在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术。,第四节其它实验性操作技术,现在显微操作装置的设计越来越精密，已经有可能对细胞核进行解剖和注入微量物质（如核酸分子片段）。,NT-88NE-N型显微操纵仪(日本Nikon),第四节其它实验性操作技术,山东省海洋生物工程重点实验室,细胞显微解剖手术图解,第四节其它实验性操作技术,显微操作,两栖类核移植实验图解,第四节其它实验性操作技术,三、细胞融合,真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合(cellfusion)或细胞杂交(cellhybridization)。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。,第四节其它实验性操作技术,目前诱导细胞融合的方法有三种：,1.病毒介导的细胞融合（如仙台病毒）2.化学介导的细胞融合（如PEG）3.电激介导的细胞融合,第四节其它实验性操作技术,Figure3-33.Theproductionofhybridcells.Humancellsandmousecellsarefusedtoproduceheterocaryons,whicheventuallyformhybridcells.Theseparticularhybridcellsareusefulformappinghumangenesonspecifichumanchromosomesbecausemostofthehumanchromosomesarequicklylostinarandommanner,leavingclonesthatretainonlyoneorafew.Thehybridcellsproducedbyfusingothertypesofcellsoftenretainmostoftheirchromosomes.,细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，如动植物育种和制取单克隆抗体等。,AB,A,B,杂交细胞,低产抗倒伏,高产易倒伏,高产抗倒伏,长命无分泌物,短命分泌抗体,长命分泌抗体,第四节其它实验性操作技术,单克隆抗体制备的杂交瘤技术,第四节其它实验性操作技术,免疫学上的一场革命,B淋巴细胞能分泌特异抗体，但不能长期培养，瘤细胞可以在体外长期培养，但不分泌特异抗体。于是Kohler和Milstein1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。,四、染色体分析技术,（一）染色体标本制做与核型分析:,1.染色体标本制做:,华裔学者庄有兴(JoeHinTjio)和瑞典学者A.Levan合作，利用低渗法研究胎儿肺组织，终于在1956年首次确定了人类染色体数是46条，而不是前人所主张的48条。,美籍华人学者徐道觉(T.C.Hsu)首先创用低渗法。,第四节其它实验性操作技术,人类的染色体标本,1.植物血球凝集素(phytohemagglutinin,PHA)可使淋巴细胞返幼，恢复分裂能力；（适于外周血培养中）2.秋水仙素通过破坏纺锤丝使中期染色体不发生分离；3.低渗处理使细胞膨胀，使染色体分散开来；4.空气