细胞生物学的研究方法课件

医学细胞生物学（配套教材）,第三章细胞生物学研究方法,TechnologyforCellBiology,学习目的与要求,掌握细胞生物学基本研究方法的原理和应用。熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点。了解细胞生物学研究方法的进展。,第三章细胞生物学研究方法,TechnologyforCellBiology,第一节显微镜技术,一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术三、纳米显微技术四、超分辨光学显微技术,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率1.分辨率（resolution，R）显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能分辨被检物体微细结构最小间隔的能力。,一、光学显微镜技术,Cell,2010(143):1047-1058,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,不同显微结构的尺寸,由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核糖体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶。虚线为光学显微镜分辨极限。,Cell,2010(143):1047-1058,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,2.分辨率公式,n=聚光镜和物镜之间介质的折射率，空气为1，油为1.5。=标本对物镜镜口张角的半角，sin的最大值为1。=照明光源的波长，白光0.5m。,横向分辨率Rx,y=0.61/nsin,纵向分辨率Rz=2/(nsin)2,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,3.组织切片制备过程固定（fixation）使大分子交联而保持在原有的位置上，防止结构移位或信息丢失。常用的固定剂：戊二醛、甲醛包埋（embedding）使组织形成硬块，便于切片。常用的包埋剂：石蜡、树脂,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,3.组织切片制备过程切片（section）切片厚度为110m。染色（staining）增大反差。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,组织切片制备过程,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,宫颈鳞癌组织切片,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像1.荧光和荧光染料荧光荧光分子可以在吸收特定波长的光后，发射出更长波长的可见光，称为荧光。前者称为激发光(excitationlight)，后者称为发射光(emissionlight)。荧光染料由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色，因此也称荧光染料。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,常见荧光分子的激发光与发射光波长范围,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,荧光素(fluorescein)，绿色荧光,四甲基罗丹明(tetramethyrhodanmine)，红色荧光,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像,2.荧光显微镜工作原理荧光显微镜（fluorescencemicroscope）的结构特点：以高压汞灯和弧光作为光源。两组滤光片。,荧光显微镜的光学系统,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像,3.应用成像反差强，检测灵敏度高。定性、定位和定量的研究组织内的荧光标记物质。对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(三)相差显微镜通常被用于观察活细胞,原理：,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,相差显微镜（phasecontrastmicroscope）：利用光的衍射和干涉效应把透过标本不同区域的光波的光程差变成振幅差，使活细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。,(三)相差显微镜通常被用于观察活细胞,应用：活细胞观察,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,相差显微镜观察培养中的HeLa细胞,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,相差显微镜下观察到的悬浮生长的昆虫草地夜蛾卵巢Sf9细胞,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,原理：散射光成像。应用：分辨率不高。适合观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和真菌等。,(四)暗视野显微镜通过散射光成像,暗视野显微镜工作原理,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(五)显微电影摄影技术记录细胞或细胞器的运动过程原理：用显微电影摄影术或电视录像以一定时间间隔拍摄。应用：准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(六)共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色三维图像,原理：单色激光作为光源。共聚焦：物镜和聚光镜互相共焦点，只有从标本焦面发出的光线聚焦成像，焦面以外的漫射光不参加成像。逐点扫描。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(六)共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色三维图像,应用：进行连续的光学切片，通过电脑进行三维重建。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,共聚焦激光显微镜工作原理示意图,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,共聚焦激光显微镜下的血管内皮细胞微丝的分布,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,共聚焦激光显微镜获得被检物体三维结构的原理及呈现的三维图像,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,以电子束作光源，波长短，分辨率高。电子显微镜分辨率理论值：0.002nm实际值：0.1nm生物样品：2nm电镜下观察到的结构称为超微结构。,二、电子显微镜技术,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(一)透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）,光学显微镜与透射电子显微镜的比较,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,透射电子显微镜标本制备过程：固定：双重固定锇酸固定脂类，戊二醛固定蛋白。脱水：含水标本干扰观察。包埋：环氧树脂是常用包埋剂。,(一)透射电子显微镜,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,透射电子显微镜标本制备过程切片：电子的穿透力有限，需制作超薄切片，厚度通常为50100nm。染色：生物分子散射电子能力弱，需通过重金属染色，增大反差，常用锇、铀、铅等重金属的盐类。,(一)透射电子显微镜,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,(二)扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）,原理：通过电子束照射在标本后产生的二次电子成像，二次电子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关。应用：可以直接观察标本表面的三维形态。,科学ScientificAmerican中文版,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,(二)扫描电子显微镜,科学ScientificAmerican中文版,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,扫描电镜的工作原理,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,扫描电镜观察的有丝分裂中期染色体形态（中国医科大学宋今丹提供）,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,凋亡细胞及凋亡小体透射电镜照片(左)和扫描电镜照片(右)，显示凋亡细胞的细胞核固缩，凋亡小体正从细胞脱落。（中国医科大学宋今丹提供）,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(三)透射电子显微镜借助金属投影、冰冻断裂及冰冻蚀刻技术可获取三维图像,1.金属投影法（metalshadowing）原理：以一定的倾斜角度向样品表面喷重金属，显示投影效果，给出样品表面三维结构。应用：观察蛋白、核酸类大分子，病毒颗粒及细胞壁,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,2.冰冻断裂（freeze-fracture）,样品制备：,应用：观察细胞膜性结构的内部构造。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,2.冰冻断裂（freeze-fracture）,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,叶绿体内膜冰冻断裂复形，显示内膜上存在大量膜蛋白,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,3.冰冻蚀刻（freeze-etch）,应用：观察细胞的内部构造。,样品制备：,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,3.冰冻蚀刻（freeze-etch）,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,冰冻蚀刻显示昆虫肌肉细胞中的蛋白纤维,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,纳米尺度：1nm100nm生命是纳米尺度的分子活动，细胞是纳米组装机的集合体。扫描隧道显微镜和原子力显微镜的分辨率和可操控的颗粒在纳米水平，被称作纳米显微技术。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,1.扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope,STM）,原理：使用原子尺度的探针在标本的表面进行扫描，在探针针尖和样品间施加一定电压，产生随标本表面形貌变化的隧道电流。特点：分辨率高，可在大气和液体等非真空状态下工作。应用：直接观察大分子的三维结构，如DNA双螺旋结构。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,1.扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope,STM）,扫描隧道显微镜下的人红细胞血影,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,2.原子力显微镜（atomicforcemicroscope，AFM）原理：通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微观信息。特点：可以在三态（固态、气态和液态）状况下工作。应用：活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测进行单个分子操作。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,2.原子力显微镜（atomicforcemicroscope，AFM）,针尖的曲率半径通常为5-10nm,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,原子力显微镜下的中国仓鼠卵巢细胞原子力显微镜下的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,原子力显微镜观察细胞膜表面，显示两种分子大小不同的膜脂参与了此细胞膜的组成。原子力显微镜测定大分子间的作用力。左图中DNA分子固定在支持物上，原子力显微镜的探针吸附了与DNA分子结合的蛋白。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、超分辨光学显微技术,由光的衍射效应导致的光学显微镜分辨率极限称为Abbe限度(Abbelimit)。应用新的光学原理、发光/示踪分子和信号分析技术，建立起了能够突破Abbe限度的超分辨显微技术，使光学显微镜的分辨率达到了3050nm的纳米尺度。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、超分辨光学显微技术,光的衍射效应使物镜的焦点呈椭圆形(左)；当两点间的距离大于衍射限度时，物镜能够呈现两个像，如两根微管的横切面A；当两点间的距离小于衍射限度时，物镜不能够呈现两个像，如两根微管的横切面B。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,STED显微技术成像与共焦显微技术成像比较以线粒体膜蛋白TOM20为标志蛋白，左上为共焦显微镜呈现的线粒体结构，右上为STED显微镜呈现的线粒体结构。左下为TOM2和线粒体基质蛋白HSP70在共焦显微镜下呈现的线粒体结构。右下为由STED技术重建的线粒体三维结构。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,SIM显微技术成像与共焦显微技术成像比较将核孔复合体标记成红色，核纤层蛋白B标记成绿色、DNA标记成蓝紫色，用共焦显微镜呈现的细胞核中间位置横切面结构，小图为方框内的细微结构(上)；相同方法标记细胞核，SIM技术三维重建后呈现的细胞核中间位置横切面结构。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,第二节细胞的分离和培养,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,从组织中分离细胞的第一步是将组织制备成游离的细胞悬液。,一、不同类型细胞的分离,细胞分离需根据不同细胞的特征采用不同的方法。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,(一)离心方法利用细胞的密度特性可有效分离不同的细胞。如血浆白细胞和红细胞的分离。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,流式细胞仪（flowcytometer）：从多细胞悬液中分离目的细胞的精密仪器。样品处理：用带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞。分离速度：2万个细胞/s。分离纯度：95%。,(二)流式细胞术,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,(二)流式细胞术,BeckmanFC500流式细胞仪外形,流式细胞仪工作原理,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,BeckmanFC500流式细胞仪分析结果,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(三)免疫磁珠法,利用带有特定单抗的免疫磁珠（immunomagneticmicrosphere）与靶细胞的特异结合，快速地从多细胞悬液中将目的细胞分离出来。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,(三)免疫磁珠法,分离纯度：9599,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,(四)激光俘获显微切割技术（LaserCaptureMicrodissection，LCM）原理：在载玻片上制作冰冻或石蜡切片并染色，通过直接的显微镜观察，用能量较低的红外激光切割而获得所需要的组织细胞，甚至单个细胞。应用：从组织切片中精确地分离一个单一的细胞,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,(四)激光俘获显微切割技术,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、细胞培养,细胞培养(cellculture)：从机体中取出组织或细胞，模拟体内的生理环境，使之能够继续生存、生长和增殖的一种方法。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、细胞培养,1.条件营养条件：培养基：RPMI-1640、DMEM。血清。5%CO2无菌环境,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,细胞培养的基本设备,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,2.原代培养和传代培养原代培养（primaryculture）：直接取材于有机体组织的细胞培养。传代培养（secondaryculture）：原代培养的细胞从培养瓶中取出，以1:2以上的比例的扩大培养。传代培养的细胞通常表现出其来源组织的分化特征。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、细胞培养,3.细胞系细胞系（cellline）：在培养的细胞中产生“不死”的变异细胞，这种细胞可以无限繁殖、传代。细胞系的来源包括培养过程中发生转化的正常细胞和取材于肿瘤组织的原代培养细胞。细胞株（cellstrain）：用细胞克隆化的方法进一步改善细胞系的均一性，即分离出单个细胞使之增殖形成的细胞群。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、细胞培养,第三节细胞组分的分离和纯化技术,一、细胞裂解二、细胞器及细胞组分的分级离心三、蛋白质的分离与鉴定四、核酸的分离纯化与鉴定,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、细胞裂解,在细胞组分的分级离心前，首先破碎细胞，制备细胞匀浆液。方法：低渗透压；超声振荡；强制通过微孔；机械破碎及研磨；去垢剂：如SDS、TritonX-100、NP-40常用于蛋白质的抽提；离液剂：如盐酸胍、尿素常用于细胞DNA和RNA的抽提。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、细胞器及细胞组分的分级离心,(一)差速离心（differentialcentrifugation）方法：从高速到低速逐级沉降。分离对象：体积、质量差别较大的颗粒。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(二)速度沉降（velocitysedimentation）方法：在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加的蔗糖溶液密度梯度(通常5%20%)。分离对象：沉降系数不同的颗粒。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、细胞器及细胞组分的分级离心,(三)平衡沉降（equilibriumsedimentation）方法：在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的蔗糖或氯化铯溶液密度梯度。分离对象：密度不同颗粒。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、细胞器及细胞组分的分级离心,速度沉降(A)和平衡沉降(B)离心的比较,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、细胞器及细胞组分的分级离心,(四)非细胞体系(cellfreesystem)1.概念非细胞体系是指从分级分离得到的具有生物功能的细胞抽提物。2.应用将某个生物过程与细胞中发生的其他复杂的反应分割开来，从而确定其详细的分子机制，研究各种细胞器及细胞成分的功能。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、细胞器及细胞组分的分级离心,三、蛋白质的分离与鉴定,(一)柱层析（columnchromatography）,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,1.离子交换层析填充基质：离子交换树脂。分离原理：电荷不同。2.凝胶过滤层析填充基质：多孔性凝胶颗粒。分离原理：大小不同。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质的分离与鉴定,(一)柱层析（columnchromatography）,3.疏水性层析填充基质：带有疏水性基团的颗粒。分离原理：疏水性不同。4.亲和层析填充基质：结合有酶底物、特异性抗体或抗原的颗粒。分离原理：亲和性不同。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质的分离与鉴定,(一)柱层析（columnchromatography）,三种层析用的基质,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(二)高效液相层析（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）,填充基质：310m的微小球型树脂。特点：分离速度快、分离度高。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质的分离与鉴定,(二)高效液相层析,高效液相分子筛色谱测定纯化蛋白的分子量,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质的分离与鉴定,(三)蛋白质电泳,蛋白质带有净电荷，具有不同形状、大小以及净电荷的蛋白质分子在电场中会产生不同的迁移速率，进而被分离。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质的分离与鉴定,(三)蛋白质电泳,1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSpolyacrylamidgelelectrophoresis，SDS-PAGE）支持体：聚丙烯酰胺。样品处理：SDS还原剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇分离原理：依据分子量的不同分离蛋白质。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质的分离与鉴定,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE）,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,2.等电聚焦（isoelectricfocusing）电泳支持体：丙烯酰胺凝胶。条件：两性电解质在电场当中形成pH梯度。分离原理：依据等电点不同分离蛋白质。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质的分离与鉴定,2.等电聚焦（isoelectricfocusing）电泳,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质的分离与鉴定,3.双向电泳原理：等电聚焦与SDS-PAGE结合。在长条状凝胶介质中进行等电聚焦电泳。将凝胶条横放于聚合好的平板SDS-丙烯酰胺凝胶上进行垂直电泳。应用：可一次分离数千种蛋白。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质的分离与鉴定,四、核酸的分离纯化与鉴定,(一)差速离心沉淀是核酸分离纯化的主要方法,DNA还是RNA，它们在细胞中总是与蛋白质结合，以复合物的形式存在于细胞中。进行核酸分离纯化的过程就是使核酸与细胞内的其他组分分离，去除纯化试剂的污染，并保持核酸一级结构的完整性。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、核酸的分离纯化与鉴定,(一)差速离心沉淀是核酸分离纯化的主要方法,核酸的高负电荷磷酸骨架使其比蛋白、脂类、多糖等细胞内其他组分具有更高的亲水性，可通过选择性沉淀和差速离心使核酸与它们分离。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,TRIzol试剂分离RNA和DNA的主要过程,组织或细胞与适量Trizol试剂混合后立即匀浆,加入0.2倍Trizol体积的氯仿，振荡混匀，静止2min,1,2000g，4，离心10min,吸取上层无色透明的水相，加入0.75倍TRIzol体积的异丙醇，混匀，室温静置10min,1,2000g，4，离心10min，弃上清，获得RNA沉淀,吸取下层红色的有机相，加入0.3倍TRIzol体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置3min,2000g，4，离心5min，弃上清，获得DNA沉淀,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(二)凝胶电泳是鉴定核酸的主要方法,原理：核酸分子中的每个单核苷酸都带有一个负电荷，在电场中向阳极移动。应用：分离不同大小的DNA分子。支持体：琼脂糖(agarose)与丙烯酰胺。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、核酸的分离纯化与鉴定,(二)凝胶电泳是鉴定核酸的主要方法,琼脂糖凝胶电泳特点：操作简单，电泳速度快，分辨率相对较低。丙烯酰胺凝胶电泳特点：分辨率高，操作相对复杂，多用于500碱基以下的DNA分子片段的分离。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、核酸的分离纯化与鉴定,(二)凝胶电泳是鉴定核酸的主要方法,琼脂糖凝胶电泳结果,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、核酸的分离纯化与鉴定,第四节细胞化学和细胞内分子示踪技术,一、酶细胞化学技术二、免疫细胞化学技术三、放射自显影技术四、活细胞内分子示踪,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,第四节细胞化学和细胞内分子示踪技术,形态与功能相结合是细胞生物学研究的突出特点，显示细胞内大分子、小分子甚至是无机离子在细胞内分布的分子示踪技术对细胞生物学的研究尤为重要。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、酶细胞化学技术,1.细胞化学技术(cytochemistrytechnique)一类将细胞形态观察和组分分析相结合的分析方法，是在保持组织原有结构的情况下利用生物大分子、小分子、无机离子的物理、化学特性来研究它们在细胞内的分布、数量及动态变化。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、酶细胞化学技术,2.酶细胞化学技术(enzymecytochemistry)通过酶对特异底物的反应并显色来检测酶在器官、组织和细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。原理：酶与底物结合。检测方法：光度计、光镜、电镜等。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、免疫细胞化学技术,免疫细胞化学技术(immunocytochemistry，ICC)：利用免疫学中抗原抗体特异性结合的原理来定性和定位研究器官、组织和细胞中的生物活性大分子的技术。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、免疫细胞化学技术,标记方法：荧光染料标记抗体。胶体金标记抗体。酶标记抗体。反应方式：直接反应标记物标记一级抗体。间接反应标记物标记二级抗体，可增加信号强度。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,宫颈鳞癌细胞的免疫组化染色,显示NRDRB1蛋白在宫颈鳞癌组织中有特异表达，棕色为阳性表达。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、放射自显影技术,放射性自显影技术(autoradiography)：用放射性同位素标记生物样品中的大分子或其前体物质，然后通过乳胶感光(卤化银还原成为银原子)，显示出被标记物在组织和细胞内的位置、数量及其变化。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、放射自显影技术,同位素：核重量不同。核外电子数相同，化学性质相同。,放射性同位素（radioisotope）：可衰变释放出、或射线而被检测。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,常用放射性同位素：14C、3H、35S、32P。3H-亮氨酸和35S-蛋氨酸蛋白质。3H-岩藻糖和3H-甘露醇糖类。3H-胸腺嘧啶脱氧核苷、3H-胸苷或3H-尿苷核酸。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、放射自显影技术,操作步骤：放射性化合物掺入活细胞；不同时间取样制备切片；暗盒中曝光；显影和定影。应用：对生物样品中放射性同位素标记的某种分子进行定性或定量检测。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、放射自显影技术,四、活细胞内分子示踪,(一)离子探针原理：一些染料专一地与某种离子结合后会产生荧光或改变本身荧光的发射波长与强度，从而通过荧光检测可以显示该离子的量。应用：细胞内离子的实时检测。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、活细胞内分子示踪,(一)离子探针,钙离子探针Fura-2标记显示：CD437诱导TR3/Nur77易位至内质网可引起细胞内钙离子调节紊乱。（汕头大学黄东阳提供）,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(二)绿色荧光蛋白,绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）：含有238个氨基酸残基，在蓝色光源(450490nm)的激发下，发射出绿色荧光(520nm)。应用：显示特定蛋白在细胞内的定位。构建融合基因表达载体。转染细胞。荧光显微镜下观察。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、活细胞内分子示踪,辅酶II依赖性视黄醇脱氢-还原酶选择性剪接体亚型（NRDRB1）在Hela细胞中的定位。(汕头大学黄东阳提供),TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(三)荧光共振能量转移,荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）：当一个荧光供体与一个荧光受体分子彼此接近而供体的发射光谱与受体的激发光谱重叠时就会发生FRET现象，此时能量以非辐射方式由供体转移到受体。应用：实时观察细胞内蛋白与蛋白相互作用。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、活细胞内分子示踪,单分子荧光成像(singlemolecularfluorescenceimaging)和原子力显微镜是活细胞体系中单分子研究的两种核心技术。,(四)单分子示踪,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、活细胞内分子示踪,1.单分子荧光成像特点：时间分辨率高，样品激发范围小、光子收集效率高。成像：全内反式荧光显微镜和共焦激光扫描显微镜。应用：活细胞内单分子研究（配体与受体的结合、蛋白质的聚合和解聚、生物大分子的动力学行为等）。,(四)单分子示踪,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、活细胞内分子示踪,2.原子力显微镜特点：分辨率高，适合在生理条件下显示生物分子的特异性相互作用。,(四)单分子示踪,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、活细胞内分子示踪,第五节细胞功能基因组学研究技术,一、基因表达的定量分析二、基因表达的上调和下调技术三、蛋白质相互作用的研究技术四、蛋白质与核酸的相互作用研究技术五、生物芯片技术六、蛋白质组学技术七、高通量测序技术八、模式动物个体水平的基因操作技术,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(一)印迹杂交技术是定量检测基因表达变化的基本方法,一、基因表达的定量分析,Northern印迹杂交（Northernblot）技术：检测组织或细胞中特异性mRNA的方法。主要过程：RNA提取与电泳分离印迹杂交放射自显影分析,Northern杂交,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,（二）原位杂交原位杂交技术（insituhybridization，ISH）：将细胞或组织切片固定于载玻片上，使细胞中DNA或RNA在保持原来位置条件下，与标记的核酸探针进行原位杂交反应，通过放射自显影检测和显微镜观察，对材料中被杂交的核酸分子进行定位、定量分析或观察基因表达（mRNA）的水平。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、基因表达的定量分析,（二）原位杂交,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、基因表达的定量分析,聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）：是在体外对特定的DNA序列进行的重复性复制反应（扩增）。反应体系：模板DNA；耐热的DNA聚合酶；引物；4种脱氧核苷酸（dNTP）；反应缓冲液。,(三)荧光实时定量PCR技术是检测基因表达变化的常规方法,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、基因表达的定量分析,反应步骤：95变性：DNA双链解离；(2)55退火：DNA链与引物互补结合；(3)72延伸：DNA聚合酶作用下的互补链合成。,(三)荧光实时定量PCR技术是检测基因表达变化的常规方法,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、基因表达的定量分析,荧光实时定量PCR反应（quantitativePCR，qPCR）：在PCR反应体系中加入荧光染料，在每次反应循环后，检测反应管中的荧光强度。以反应管中荧光强度达到阈值时所需的PCR反应循环个数（Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、基因表达的定量分析,(三)荧光实时定量PCR技术是检测基因表达变化的常规方法,如上图所示，qPCR一般使用二步PCR扩增，即将退火和延伸整合成一步。一般在退火-延伸整合步骤结束时进行信号检测。,能够产生荧光信号的扩增产物会随着PCR反应的进行而积累。荧光强度超过阈值的循环数(Cp值)会被实时检测出来。Cp值与模板中目的片段的含量正相关。因此可以用Cp值表示目的片段的初始含量。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,一、基因表达的定量分析,(三)荧光实时定量PCR技术是检测基因表达变化的常规方法,二、基因表达的上调和下调技术,(一)外源性基因在细胞内过表达是上调基因表达水平的基本方法,cDNA克隆（cDNAcloning）：将mRNA逆转录形成的cDNA或通过体外聚合酶链式反应得到的基因片段，插入到能进行自我复制的载体（通常是质粒），实现在受体细菌内大量扩增的过程。外源性基因可以与表达载体连接后在不同的宿主细胞中表达。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、基因表达的上调和下调技术,(一)外源性基因在细胞内过表达是上调基因表达水平的基本方法,转染（transfection）：将带有外源性基因的克隆载体或表达载体导入真核细胞的过程。在表达载体启动子的驱动下，外源基因将获得过表达（over-expression），从而实现上调细胞中的目的基因表达。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA导入细胞，使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。,(二)RNA干扰技术是下调基因表达的常用方法,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、基因表达的上调和下调技术,细胞内RNA干扰机制,(二)RNA干扰技术是下调基因表达的常用方法,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,二、基因表达的上调和下调技术,三、蛋白质相互作用的研究技术,(一)免疫沉淀（immuno-precipitation，IP）过程：首先用偶联在凝胶颗粒或磁珠上的目的蛋白的抗体将细胞匀浆或裂解液中的目的蛋白沉淀出来，在此过程中能够与目的蛋白发生相互作用的蛋白会被同时沉淀下来。然后用SDS-PAGE、免疫印迹或生物质谱对沉淀出来的蛋白进行鉴定。应用：验证蛋白-蛋白的相互作用。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,免疫沉淀过程,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(二)酵母双杂交酵母双杂交（yeasttwo-hybridization）是一种在体内条件下研究蛋白质相互作用的方法。应用：筛选存在相互作用的蛋白质。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质相互作用的研究技术,(二)酵母双杂交原理：,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质相互作用的研究技术,(三)噬菌体展示（phagedisplay）应用：体外筛选蛋白质与蛋白质相互作用的技术。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质相互作用的研究技术,(A)目的多肽呈现在噬菌体表面；(B)应用噬菌体展示技术获得可与脑瘤血管特异性结合的多肽的编码DNA的过程,(三)噬菌体展示（phagedisplay）原理：,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,三、蛋白质相互作用的研究技术,四、蛋白质与核酸相互作用的研究技术,（一）染色质免疫沉淀技术,应用：体内研究DNA与蛋白质相互作用的方法。原理：,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,（二）紫外交联免疫沉淀应用：研究RNA与RNA结合蛋白相互作用原理：,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,四、蛋白质与核酸相互作用的研究技术,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,五、生物芯片技术,生物芯片(biochip)是一门由生物学、微电子学、物理学、化学和计算机科学等多学科交叉融合而成的高新技术，主要包括基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片（genechip）：将大量特定的寡核苷酸片断作为探针，排列固定于支持物表面，与标记样品进行杂交，通过检测杂交信号强度，实现对生物样品快速、并行、高效的检测的一种技术。基因芯片主要技术流程是：芯片的设计与制备，靶基因的标记，芯片杂交，杂交信号检测。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,五、生物芯片技术,蛋白质芯片(proteinchip)技术：将大量蛋白质或多肽固化于固相支持物表面，通过蛋白质蛋白质间的相互作用(如抗原抗体反应、受体配体识别等)，对样品中靶蛋白分子进行高通量检测的一种技术。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,基因芯片主技术流程,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,六、蛋白质组学技术,蛋白质组（proteome）：指在特定时空条件下某种细胞、组织或器官所含有的全部蛋白质。蛋白质组学（proteomics）：以特定时空条件下某种细胞、组织或器官所含有的全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象的学科。,蛋白质组学研究的基本技术：双向电泳质谱,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,1.双向电泳第一向：高压电场下进行等电聚焦（IEF）。第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,六、蛋白质组学技术,2.质谱原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（mz）的差异来分离并确定样品的分子质量。种类：电喷雾电离质谱（electrosprayionizationmassspectrometry,ESI-MS）。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorptionionization/time-of-flight,MALDI-TOF-MS）。,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,六、蛋白质组学技术,2.质谱串联质谱(tandemmassspectrometry，MS/MS)：可测定肽片段的序列结构。,串联质谱测定多肽氨基酸序列A.串联质谱仪结构B.肽段在串联质谱中的运动过程C.肽段断裂位点,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,六、蛋白质组学技术,质谱确定蛋白及多肽氨基酸序列,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(一)常规自动化DNA序列测定,最常使用的四色荧光自动化测序，是基于Sanger建立的双脱氧链末端合成终止法的基本原理。,七、高通量测序技术,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(一)常规自动化DNA序列测定,末端序列检测原理,测序结果,七、高通量测序技术,TechnologyforCellBiology,第三章细胞生物学研究方法,(二)DNA高通量测序,1.原理将DNA固定在芯片上，测序反应以大规模阵列形式排列，边合成边测序，不依赖于电泳，阵列上DNA合成时的单个碱基改变所发出的荧光信号